| 研究概要 |
ホスグリセレートムターゼ(PGAM)のM型(筋肉型アイソザイム)欠損症患者の遺伝学的解析を行う第一段階として我々は正常のPGAM-M genomic DNAのクローニングから開始した. というのは, 正常のDNAの構造か明らかな場合tag I DNAポリメラーゼを用いたpolymerase chain reaction法(PCR法)により数時間で患者のDNAがクローニングできるばかりでなく, 直接genomic DNAを鋳型とし構造決定か可能になるからである. 又M型genomic DNAのクローニングをし, そのプロモーダー領域を明らかにる事は筋肉に時異的に発現する種々のアイソザイムの遺伝子発現という基本的なテーマへの重要なアプローチとなる. まずPGAM-M CDNAをプローブとてヒトleukocytc genomic lilramyをスクリーンニングしたところ70万個のプラークのうち実に36個のpositive-plaqueを得た. しかし種々の解析結果からそのほとんどはPGAM-B(脳型アイソザイム)のprocessed pseudogeneであろうと考えられた. (M型とB型のcDNAのホモロジーは約75%である事からcross-hybri-digationしたものと思われる. )普通用いられる方法ではPGAM-B related gene family(processed pseudogene)をかいくぐりauthentic genomicMをクローニングする事は困難と考えられた. そこでM-cDNAをプローブとしたEcoRI-digested gonomic Soutern blotにみられるmultiple hybridizing bandsのうち最もそのintensityの強い〜4.5kbと〜2.7kbの領域を切りとりEcoRI-digested xgtioにサブクローニングし2種類のenrich genomic libraryを作製した. それぞれのlibraryから1つづのクローンを得, puc18vectorにサブクローニングした. 最初に〜2.7kbのクローンの全構造を決定した所M型cDNAの3′末端(622nt〜822nt)を中央に持ち, 両サイドにintronを持つpartialauthentic M-genomic cloneである事が判明した. このintronをプローブとしてgenomic Southentic M-genomic cloneである事が判明した. このintronをプローブとしてgenomic Southentic blotを行った所予想通り〜2.7kb(Ecoの場合)にたった一本のバンドを認めた. 現在〜4.5kbのクローンにつき検討中であるが, genomic Mの5′側を含んでいる事が期待される.
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