| 研究概要 |
30残基前後のアミノ酸から成る生理活性ポリペプチドを遺伝子工学的手法により大量に産生する方法の確立を本研究の目的とし, 腸管ホルモンであるVasoactive Intestinal PoLypeptide(VIP)の生成を行なった. VIPおよびそのN末端側にVal-Pro-Argのα-スロンビン認識部位を含むポリペプチドに対応するDNAを6種のデオキシオリゴヌクレオチドから構築した. これを大腸菌プラスミドに含まれるc-Ha-ras遺伝子の下流領域のEcoRI部位に挿入してc-Ha-ras遺伝子とVIP遺伝子の融合遺伝子を含むプラスミドを構築した. つづいて, プラスミドで大腸菌をトランスホームし, 目的の遺伝子を含む大腸菌をスクリーニングした. さらに, c-Ha-ras-VIP融合蛋白質を大量に産生する大腸菌を選択し, 大腸菌を大量培養した. リゾチーム処理により大腸菌を溶菌し, 〓M尿素を含む緩衝液にて目的とする融合蛋白質を含む画分を抽出した. この画分についてDEAE-セファセル, セファデックスG-75ゲル〓過カラムクロマトグラッフィを行って, ほぼ単一の蛋白質を得た. この蛋白質をα-スロンビンで消化し, DEAE-セファセルカラムクロマトグラッフィによりVIPを含む画分を得た. さらに, 逆相HPLCにより精製を行なって単一のVIPを得た. 最終標品はアミノ酸組成分析を行なって同定した. 今後の課題は得られたVIPの生物活性の測定である.
以上の方法により低分子量のポリペプチドを効率良く, かつ大量に得る方法を確立した.
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