|
1.特定の塩基を認識する機構の研究:RNase T_1と阻害剤2′GMPの複合体のX線結晶解析をもとに、グアニン塩基認識部位のアミノ酸残基を人工的に置換し、アデニン塩基特異性に変えることを試みた。そのために、RNase T_1に比べ、アデニン塩基にも親和性のあるRNase Msとのハイブリッドプロテインを2種類と塩基結合部位のふたの役目をしているTyr45をTrpに変えた変換体と、グアニン塩基のN1位を認識しているGlu46をAlaに変えた変換体を作製した。pApCに対する切断活性/pGpCに対する切断活性の相対活性で比較すると、いずれもRNase T_1に比べ数10から数1000倍、特異性が変化していた。しかし活性の絶対値はRNase T_1に比べ著しく低下していた。活性の低下をできるだけ抑えたまま特異性を変化させる為に、今後、RNase T_1と基質類似体の複合体のより精密な構造の情報を得ることを計画している。
2.RNA鎖切断反応機構の研究:カビ由来のRNaseでは、His40、Glu58、Arg77、His92が共通に存在し、今までの化学修飾等の結果から触媒残基と推定されている。RNase T_1におけるこれら残基の機能を明らかにするために、His40→Ala、Thr、Asp、Glu58→Ala、Gln、Asp、Arg77→Lys、Thr、His92→Alaの9種類の変換体を作製し、pGpCを基質とし反応速度論的解析を行なった。これらの結果をもとに以下の反応機構を考え出した。『まずArg77が基質のリン酸部分を捕え、基質を結合部位に引き込む。次いでTyr42〜Tyr45のループ部分でグアニン塩基のより精密な認識が成される。切断反応の第一段階は、His40が塩基触媒として基質の2′水酸基からプロトンを引き抜き、同時にHis92は酸触媒として働き、2′、3′環状リン酸体を生成する。第2段階は今とは逆の働きで、環状リン酸体が加水分解される。Glu58は反応の引き金となるHis40の近傍に位置し、その塩基触媒としての役目を高める働きをする。』
|
