| 研究課題/領域番号 |
62570965
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
中川 照眞 京都大学, 薬学部, 助教授 (70025708)
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| 研究分担者 |
渋川 明正 京都大学, 薬学部, 助手 (30170913)
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| キーワード | 膜タンパク質の迅速精製システム / 成長ホルモン受容体 / サイズ排除クロマトグラフィー / アフィニティークロマトグラフィー / グルタルアルデヒド / グルタルアルデヒドポリマー / 固定化タンパク質 / 架橋剤 |
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| 研究概要 |
前年度において、高速液体クロマトグラフィーを用いる膜受容体の迅速精製システムを開発し、成長ホルモン受容体の活性画分をウサギ肝臓から分離することに成功した。そこで本年度は、分離された受容体の純化の程度及び回収率を測定し、さらに受容体・ホルモン間の結合定数を評価し、本システムの完成度を調査すると共に改良の可能性を検討した。即ち、^<125>I標識成長ホルモンを用いて受容体との結合率(B/F比)を測定し、結合定数を算出した結果、6×19^<-9>M^<-1>が得られ、この値は文献値と一致した。また、本システムを用いる単回の精製操作によって、受容体は肝臓ホモジネートに対して約1200倍に純化され、その回収率は約10%であった。本法は、従来のオープンカラム法に比べて所要時間が大幅に(約10分の1)短縮され、分離効率及び結合活性の保存能が優れているが、一回に処理できる試料量が比較的少ないので、この点を改良するために、アフィニティーゲルの調整方法の改良を検討した。即ち、前年度においては、ホルミル化された中圧ポリマーゲルを担体として、これに成長ホルモンを結合していたが、アミノ化された高圧ポリマーゲルとタンパク質とをグルタルアルデヒド(以下GAと略す)で架橋する方法を検討した。その結果、GAをアルカリ性水溶液中で加熱処理して用いる方が、未処理のGA水溶液を用いる従来法より優れていることを見出した。アルカリ処理によってGA水溶液中に、GAのオリゴマーが生成していることがわかったので、次にこのGAオリゴマーを単離して、それを架橋剤とする新しい固定法を検討した結果、一層優れた方法を開発することができた。この改良GA架橋法はアフィニティーゲルの調整だけでなく、一般に酵素、タンパク質等のアミノ基を有する生理活性物質の固定化に広く有用であると考えられる。
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