|
2次元マッピングによる糖鎖構造解析は次の方法で行うことができる。糖蛋白質をヒドラジン分解し、遊離したアミノ基をNーアセチル化する。得られた糖鎖をピリジアルアミノ化し、過剰の反応試薬をゲル3過カラムにより除く。得られたPAー糖鎖は次の様にして、データー処理装置付HPLCにより分析する。
1)荷電量により分離するため、DEAEカラムによるHPLCを行う。これによりシアル酸の結合数を決定する。ヌシアリダーゼ消化後再度DEAEーHPLCを行うことにより、シアル酸が結合していることが確認出来る。
2)PAー中性糖鎖(シアリダーゼ消化物)に対し、サイズフラクショネーションHPLCを行う。これによりPAー糖鎖はその分子サイズにより分離される。
3)PAー糖鎖を逆相HPLCを用いて分析することにより、その分子サイズよりも化学構造(配糖体結合、結合位置、構成糖)の差により分離することが出来る。実際にサイズフラクショネーションHPLCと逆相HPLCを用いることにより数多くのPAー糖鎖を分離することが出来た。
4)サイズフラクショネーションHPLCにおいても逆相HPLCにおいても、PAー糖鎖の構造と溶出時間の間に一定の規則性が成立することが分かった。この規則性オリゴマンノース型、Nーアセチルラクトサミン型、シアル酸の結合したPAー糖鎖にも当てはまった。この規則性を用いることによりPAー糖鎖の構造決定をより精度よく行うことが出来る。
5)PAー糖鎖のエキソグリコシダーゼ消化物についても2)、3)、4)を行うことによりさらに精度よく構造推定することが出来る。
上記3法を用いて天然型インターフェロンーγ0.016mgの糖鎖構造の推定を行うことが出来た。今後さらに高感度化することが望まれる。
|
