細胞培養下における顕微蛍光測光システムの試作開発と応用

1988 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 62870017
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 蘆原 司 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (30079719)
• 研究分担者: 小西 英一 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (50186714) ; 細川 洋平 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (60137130)
• キーワード: 顕微測光 / 組織培養 / DNA

研究概要

〈1.初年度に試作開発した細胞培養下の顕微蛍光測光システムの改良〉 1)励起光照射法に関する研究:培養細胞を倒立位相差顕微鏡観察下からDNA顕微測光法を行うには、ハロゲンランプから水銀ランプに光源を切り替えるが、励起フィルターとダイクロイック・ミラーの切り替え動作および励起光の短時間照射・測光のための装置を考案した。 2)解析プログラムの作成・改良:自動ステージを結合した位相差顕微鏡観察下における培養細胞の位置情報、形態情報、DNA顕微測光の各データを入力・解析するための、パソコン・プログラムを作成し、改良・一般化を図った。 〈2.生体蛍光染色法の改良〉 1)核DNA蛍光染色法:核DNA蛍光染色にはHoechst 33342が最適であり、細胞の種類に応じた、培養液中の染色濃度、染色後測光までの待ち時間(15ー30分)などの条件を検討し標準化した。 2)その他:生死細胞分別染色法、自由Caイオン染色法を標準化した。 〈3.本システムを用いた細胞培養下の解析的研究〉 1)培養細胞の増殖サイクル解析:Hoechst 33342(0.005μg/ml)で染色して15分後にV励起でDNA蛍光測光し、各細胞の核DNA量に基づいて増殖サイクルの位置を決定する。その後、3、6、12時間後、または4、8、12時間後にそれぞれ同濃度で再染色し、同一細胞群のDNA蛍光測光を行い、時間軸に対するDNA量変動のグラフを求めて、個々の細胞のS期時間を推定することを可能にした(8ー12時間)。 2)その他の生体染色・顕微測光法の応用:Fura 2による細胞内自由Caイオンの染色・濃度測光、carboxyfluorescein diacetateによるエステラーゼ染色とPI染色の重染色に基づく生死細胞の分別・測光解析、蛍光標識ビーズを取り込ませた細胞の貧食性の測光解析の各方法論を標準化した。 3)生細胞の蛍光画像解析の可能性も示した。

研究成果

• [文献書誌] 芦原司 他: 臨床検査. 31(11). 1355-1362 (1987)
• [文献書誌] 芦原司 他: フローサイトメトリー. 7. 6-18 (1988)
• [文献書誌] 芦原司 他: 生体の科学. 39(5). 410-411 (1988)
• [文献書誌] 芦原司 他: 医学のあゆみ. 147(7). 583-586 (1988)
• [文献書誌] Ashihara,T.;et al.: In preparation for Acta Histochem.Cytochem.
• [文献書誌] Ashihara,T.;et al.: In preparation for Acta Histochem.Cytochem.
• [文献書誌] 芦原司 他: "顕微蛍光測光法による癌診断組織細胞化学1987" 日本組織細胞化学会編,学際企画, 15 (1987)
• [文献書誌] 芦原司 他: "RNAとDNAの同時測光法とその癌診断への応用法組織細胞化学1988" 日本組織細胞化学会編,学際企画, 20 (1988)