先天性結合組織病の酵素的およびcDNAレベルでの診断法の開発

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 62870042
• 研究機関: 大分医科大学
• 研究代表者: 新海 浤 大分医科大学, 医学部, 助教授 (90030957)
• 研究分担者: 片桐 一元 大分医科大学, 医学部, 助手 (00204420) ; 本多 朋仁 大分医科大学, 医学部, 助手 (80173665) ; 藤原 作平 大分医科大学, 医学部, 講師 (90181411)
• キーワード: 骨形成不全症 / デルマタン硫酸プロテオグリカン / 二次元電気泳動 / アミノ酸配列 / 高速液体クロマトグラフィ-

研究概要

骨形成不全症母娘例からI型コラ-ゲンのα_1(I)鎖に相当する異常コラ-ゲンを見い出した。合成されたコラ-ゲンのHP/P比、HL/Ly比は正常と比べて有意差はみられなかった。一次元SDS・PAGEでは1本のα鎖は正常α_1(I)鎖よりもやや分子量が大きく、合成比は(α_1(I)と異常α鎖)は1であり、一次元SDS-PAGEのあと、70%ギ酸・CNBr処理後再び12.5%ゲルを用いたSDS-PAGEではCB8に相当するペプチドが分子量が大きいことが判明した。この部位に余部のペプチドが挿入されていることが推定されたので、現在CB8のC,N未端ペプチドに相当する塩基プライマ-を合成し、培養細胞からmRNAを抽出、cDNA(1本鎖)を作製、遺伝子増副法により塩基配列の決定を行っている。コラ-ゲン分子異常を見る方法として前回報告したHPLC法に比べて上記方法は時間が要するものの比較的簡単で技術的にも熟練を要しない点が良いと思われる。高速液体クロマトグラフィ-によるHP,Pro,HL,Lysの分離ではHPはAsp,HLはHisとバッファ-のpHに依存するため、厳密なpHの合ったバッファ-を作製することが必要で、測定する前日、少くとも1週間以内の液であることが必要であることが判明した
。コラ-ゲン線維の変次構造の安定化に関与するデルマタン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質は、従来考えられていた構造と異なり、そのデルマタン硫酸結合部位は中央部分にありそのアミノ酸配列はLys-Ser-Ser-Gly-Ile-Glv構造を呈する。N未端側はAsp-Glu-Ala-Ser-Gly-Ile-Gly-Pro-Glu構造を示すことが判明し、現在塩基配列からもその構造が正しいか否かを検討し、遺伝子レベルでの異常症における測定法の解析も出来る可能性が出来て来た。

研究成果

• [文献書誌] T.Kitazono,T.Imaizumi,S.Imayama,H.Shinkai,A.Takeshita,M.Nakamura: "Two cases of myocardial infarction in type 4 Ehlers-Danlos syndrome" CHEST. 95. 1274-1277 (1989)
• [文献書誌] 山口卓朗,溝口尚則,平山善章,雨宮次生,山本憲嗣,入船弘子,新海浤: "Ehlers-Danlos症候群の1症例" 眼科臨床医報. 83. 79-83 (1989)
• [文献書誌] H.Fushimi,M.Kaneyama,H.Shinkai: "Deficency of the core proteins of dermatan sulfate proteoglycans in a variant form of Ehlers-Danlos syndrome" J.Internal Med. 225. (1989)
• [文献書誌] A.Pool,J.Skiner,T.Honda,H.Shinkai: "Chondron from articular cartilage(II)Analysis of glycosaminoglycans in the cellular microenviroment of isolated chondron" Conect.Tissue Res.18. (1989)
• [文献書誌] 新海浤: "細胞外マトリックスのバイオサイエンスとバイオテクノロジ-細胞外マトリックスの合成と分解、先天異常" Industrial Publishing Consulting Inc, (1990)
• [文献書誌] H.Shinkai: "Diseases of the connective tissue in the skin Proteoglycans;Structure,biosynthesis and degradation" Martin Dunitz Publischer, (1990)