神経伝達物質受容体およびイオンチャンネルの構造と機能に関する研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63065003
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 沼 正作 京都大学, 医学部, 教授 (50025516)
• 研究分担者: 藤田 至彦 京都大学, 医学部, 助手 (80192730) ; 福田 和彦 京都大学, 医学部, 助手 (90199224) ; 竹島 浩 京都大学, 医学部, 助手 (70212024) ; 田辺 勉 京都大学, 医学部, 助手 (70183069) ; 井本 敬二 京都大学, 医学部, 講師 (00176512)
• キーワード: cGMP-gatedチャンネル / Na^+チャンネル / Ca^<2+>チャンネル / K^+チャンネル / Ca^<2+> releaseチャンネル / cDNA発現 / 部位特異的変異 / 電位感受機構

研究概要

ア)網膜光受容細胞cGMP-gatedチャンネルのcDNAをクローン化し、その塩基配列を決定することにより一次構造を明らかにした。さらに、組織中のチャンネルと同様の性質を示すカチオンチャンネルをcDNAから発現させることに成功した。 イ)Na^+チャンネルのsegment S4(正電荷を有するアミノ酸残基を持ち電位依存性チャンネルの特徴的構造をなす)に変異に導入し、変異Na^+チャンネルの性質の電気生理的解析から、segment S4がチャンネル活性化の電位感受機構に直接関与していることを示した。またrepeat間を切断したNa^+チャンネルの解析から、repeatIIIとIVの間の部位がチャンネルの不活性化に関与することを示した。またrepeat IのS5とS6の間に位置し、387番目の残基であるグルタミン酸残基の変異により、Na^+チャンネルのテトロドトキシン、サキシトキシンに対する感受性が失われることを示した。3種のNa^+チャンネルI、II、III mRNAのラット脳における分布が発生段階で異なることを示した。 ウ)心筋Ca^<2+>チャンネルブロッカー受容体cDNAのクローン化、塩基配列決定により本受容体の一次構造を明らかにし、発現させることによりL型Ca^<2+>チャンネル活性を証明した。骨格筋リアノジン受容体cDNAをクローン化し、その塩基配列を決定することにより本受容体の一次構造を明らかにした。さらにクローン化したcDNAをCHO細胞に発現させることにより、リアノジン結合活性を検出し、Ca^<2+> releaseチャンネルの機能発現に成功した。 エ)NG108ー15 neuroblastoma-glioma雑種細胞よりK^+チャンネルのcDNAをクローン化し、その塩基配列から本チャンネルの一次構造を決定し、cDNA発現によりdelayed rectifierの性質を持つチャンネルであることを示した。 オ)cDNAと発現ベクターを用いてニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットを発現させたCHO細胞の大量培養を行い、これらの細胞から膜蛋白を精製して相当量の標品を得ている。

研究成果

• [文献書誌] Takashima,H.et al.: "Primary structure and expression from complementary DNA of skeletal muscle ryanodine receptor" Nature. 339. 439-445 (1989)
• [文献書誌] Stuhmer,W.et al.: "Structural parts involved in activation and inactivation of the sodium channel" Nature. 339. 597-603 (1989)
• [文献書誌] Mikame,A.et al.: "Primary structure and functional expression of the cardiac dihydropyridine-sensitive calcium channel" Nature. 340. 230-233 (1989)
• [文献書誌] Beam,K.G.,Tanabe,T.& Numa,S.: "Structure,function,and regulation of the skeletal muscle dihydropyridine receptor" Ann.N.Y.Acad.Sci. 560. 127-137 (1989)
• [文献書誌] Beckh,S.et al.: "Differential regulation of three sodium channel messenger RNAs in the rat central nervous system during development" EMBO J.8. 3611-3616 (1989)
• [文献書誌] Kaupp,U.B.et al.: "Primary structure and functional expression from complementary DNA of the rod photoreceptor cyclic GMP-gated channel" Nature. 342. 762-766 (1989)
• [文献書誌] Yokoyama,S.et al.: "Potassium channels from NG108-15 neuroblastoma-glioma hybrid cells:Primary structure and functional expression from cDNAs" FEBS Lett.259. 37-42 (1989)
• [文献書誌] Noda,M.et al.: "A single point mutation confers tetrohotoxin and saxitoxin insensitivity on the sodium channel II" FEBS Lett.259. 213-216 (1989)
• [文献書誌] Penner,R.et al.: "Functional expression of the calcium release channel from skeletal muscle ryanodine receptor cDNA" FEBS Lett.259. 217-221 (1989)
• [文献書誌] Fukuda,K.et al.: "Selective effector coupling of muscarinic acetylcholine receptor subtypes" Trends Pharmac.Sci.Suppl.10. 4-10 (1989)