神経伝達物質受容体およびイオンチャンネルの構造と機能に関する研究

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63065003
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 沼 正作 京都大学, 医学部, 教授 (50025516)
• 研究分担者: 藤田 至彦 京都大学, 医学部, 助手 (80192730) ; 福田 和彦 京都大学, 医学部, 助手 (90199224) ; 竹島 浩 京都大学, 医学部, 助手 (70212024) ; 田辺 勉 京都大学, 医学部, 助手 (70183069) ; 井本 敬二 京都大学, 医学部, 助教授 (00176512)
• キーワード: ニコチン性アセチルコリン受容体 / Na^+チャンネル / Ca^<2+>チャンネル / cDNA発現 / 部位特異的変異

研究概要

ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)チャンネルのイオン選択性の分子機構を解明する目的で、変異チャンネルのアルカリ金属イオンに対する選択性を検討した結果、中間環を形成するアミノ酸残基の電荷と大きさが共にイオン選択性に重要であることが示された。また内壁形成が予測される部位の電荷を持たない極性アミノ酸残基に導入した変異の効果を解析した結果、イオン透過速度決定に重要な残基が同定された。これらの残基は環状様構造をなし中間環と共に短いチャンネル狭小部を構成すると結論した。変異Na^+チャンネルの解析から、repeat IーIVの疎水性領域S5とS6の間にある2つの相同な位置にあるアミノ酸残基の変異により、テトロドトキシンに対するNa^+チャンネルの感受性が低下し、これらの部位の正味の負電荷の減少で、単一チャンネルコンダクタンスが減少することが示された。この結果はこの領域がチャンネル外側開口部あるいは内壁を形成することを示唆する。脳Ca^<2+>チャンネルcDNAの一つ(BIと命名)をクロ-ン化し全一次構造を解明した。cDNAより発現させると、チャンネル活性は骨格筋ジヒドロピリジン(DHP)受容体α_2、βサブユニットの同時発現により劇的に増加すること、BIチャンネルは活性化閾値が高くニフェジピンやωコノトキシンに非感受性であることが示された。また遺伝性小脳変性症マウスのRNAの解析より、BIチャンネルは小脳プルキンエ細胞・顆粒細胞に存在することが示唆された。骨格筋・心筋DHP受容体からなるキメラの解析から、チャンネル活性化の速度がrepeat Iにより決定されることが明かとなった。Baculoウィルスを用い培養昆虫細胞にニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットを発現させ、精製したαサブユニットあるいはαサブユニットとδサブユニットからなる複合体を用いて、結晶化条件(界面活性剤、pH、温度、沈澱剤など)の検討を行った。

研究成果

• [文献書誌] Numa,S.et al.: "Molecular insights into excitation-contraction coupling" Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.55. 1-7 (1990)
• [文献書誌] Mori,Y.et al.: "Primary structure and functional expression from complementary DNA of a brain calcium channel" Nature. 350. 398-402 (1991)
• [文献書誌] Konno,T.et al.: "Rings of anionic amino acids as structural determinants of ion selectivity in the acetylcholine receptor channel" Proc.R.Soc.Lond.B. 244. 69-79 (1991)
• [文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Repeat I of the dihydropyridine receptor is critical determining calcium channel activation kinetics" Nature. 352. 800-803 (1991)
• [文献書誌] Pusch,M.et al.: "Single point mutations of the sodium channel drastically reduce the pore permeabitily without preventing its gating" Eur.Biophys.J.20. 127-133 (1991)
• [文献書誌] Imoto,K.et al.: "A ring of uncharged polar amino acids as a component of channel constriction in the nicotinic acetylcholine receptor" FEBS Lett.289. 193-200 (1991)
• [文献書誌] Terlau,H.et al.: "Mapping the site of block by tetrodotoxin and saxitoxin of sodium channel II" FEBS Lett.293. 93-96 (1991)
• [文献書誌] Numa,S.: "Neurotransmitter receptors and ionic channels:From structure to function,in "Fidia Research Foundation Neuroscience Award Lectures",Vol.5" Raven Press, 23-44 (1991)