超高感度微弱光撮像システムを用いた臓器循環障害過程における活性酸素生成動態の検討

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63440033
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 土屋 雅春 慶應義塾大学, 医学部・消化器内科, 教授 (60051124)
• 研究分担者: 朴沢 重成 慶應義塾大学, 医学部・消化器内科, 助手 (40181482) ; 末松 誠 慶應義塾大学, 医学部・消化器内科, 助手 (00206385) ; 三浦 総一郎 慶應義塾大学, 医学部・消化器内科, 講師 (50138012)
• キーワード: 活性酸素 / 臓器微小循環 / 化学発光 / dichlorofluorescin / digital image processor / 血管内皮細胞 / 顆粒球 / 血小板活性化因子(PAF)

研究概要

昭和63年度に確立したin vitroにおける活性酸素放出反応の化学発光法による撮像システムを応用して、平成元年度は、ラット腸間膜微小循環系において、化学発光物質luminolを表面灌流し、血小板活性化因子(PAF)を投与することにより内皮に膠着反応を起こした顆粒球からの微弱発光を、in vivoで撮像、数量化することに世界で初めて成功した(J.Biochem.)。また膠着顆粒球からのoxidantsの放出は膠着反応を惹起させるメディエ-タ-により異なり、同濃度のPAFとleukotrieneB_4では前者がより強いmediatorであることも明らかとなった(炎症、Lipids)。一方臓器微小循環単位で顆粒球以外の活性酸素生成源の解析法を確立する目的で、細胞内にとりこまれ、過酸化脂質と反応して蛍光物質を生成するdichlorofluorescin(DCFH)を用いた実験系の開発を行った。このprobeを用いて、ラット分離灌流肝にDCFHを負荷、洗浄した後、oxidative stressのモデル実験として四塩化炭素の投与を行った。肝表面を倒立顕微鏡で観察し、蛍光強度の分布と変化をdigital image processorで解析すると、(i)蛍光は中心静脈域(zone 3)で増強する。(ii)蛍光はcytochrome P-450の阻害剤(SKF-525A)で抑制される。(iii)酸素分圧をzone 3で高く保持(逆灌流による)すると、やはり反応が抑制される、ことが明らかになった。従って、oxidative stressが、酸化酵素の臓器内分布と局所の酸素分圧によって規定されることが明らかとなった。本年度の研究実績により、luminol化学発光およびDCFH蛍光反応を利用した臓器内oxidative stressの微小循環レベルでの生体内撮像の基礎が、本研究領域で初めて確立されたことになる。

研究成果

• [文献書誌] Suematsu,M.,: "Effects of serine protease inhibitors on oxyradical burst from phagocytizing neutrophils." J.Biolum.Chemilum.4. 531-534 (1989)
• [文献書誌] Suematsu,M.,: "In vivo visualization of oxyradical-dependent photoemission during endothelium-granulocyte interaction in microvascular beds treated with platelet-activating factor." J.Biochem.106. 355-360 (1989)
• [文献書誌] Suematsu,M.,: "Platelet-activating factor and granulocyte-mediated oxidative stress-strategy for in vivo oxyradical visualization." Lipids. (1990)
• [文献書誌] Suematsu,M.,: "Intralobular heterogeneity of carbon tetrachloride-induced oxidative stress in perfused rat liver visualized by digital imaging fluorescence microscopy." Lab.Invest.
• [文献書誌] 末松誠: "炎症メディエ-タ-による血管内皮ー顆粒球相互反応活性化と活性酸素放出反応の生体内撮像" 炎症. 10. 43-48 (1990)
• [文献書誌] 末松誠: "胃粘膜再灌流障害における血管内皮ー好中球相互反応と酸素ストレスーplatelet-activating factorの役割" 脈管学. 30. 97-101 (1990)
• [文献書誌] Tsuchiya,M.: "Free Radicals in Digestive Diseases" Elsevier,Amsterdam, 244 (1989)