筋ホスホフルクトキナ-ゼ欠損症の酵素異常に関する分子生物学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63440043
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 垂井 清一郎 大阪大学, 医学部, 教授 (00028341)
• 研究分担者: 清水 孝郎 大阪大学, 医学部, 助手 (40206199) ; 桑島 正道 大阪大学, 医学部, 助手 (00205262) ; 野口 民夫 大阪大学, 医学部, 講師 (70135721) ; 河野 典夫 大阪大学, 医学部, 講師 (30093412)
• キーワード: 解糖系 / 律速酵素 / ホスホフルクトキナ-ゼ / グリコ-ゲン病VII型 / 遺伝子クロ-ニング / cDNAクロ-ニング / スプライシング / 遺伝子構造

研究概要

本研究では、解糖系の重要な律速酵素であるホスホフルクトキナ-ゼ(PFK)の筋における欠損症(グリコ-ゲン病VII型)の酵素異常の本態を遺伝子レベルにおいて解明することを目的としている。前年度までの本研究の成果により、正常ヒト筋PFKのcDNAクロ-ニングから、酵素一次構造をはじめて明らかにしたばかりでなく、正常ゲノムのクロ-ニングから、ヒト筋PFK遺伝子の部分構造を解明しつつあった。これらの知見にもとづき、本年度に以下の重要な成果を得た。
(1)、ヒト筋PFK遺伝子のクロ-ニングから、正常ヒト筋PFK遺伝子の全構造を明らかにした。筋PFK遺伝子のタンパク翻訳領域は22のエキソンから構成され、プロモ-タ-領域を含めると、その全長は25Kb以上にわたることが判明した。また本遺伝子の転写機構に、alternativeRNAスプライシングの存在と、複数のプロモ-タ-領域の存在することを、はじめて明らかにした。
(2)、欠損症患者の筋mRNAおよびゲノムDNAの分析を行なった。患者筋mRANのノザン分析から、患者筋にはほぼ正常量の筋PFKのmRNAが存することが明らかとなったが、さらに患者筋のcDNAライブラリ-を構築し、定全集cDANをクロ-ニングして解析したところ、患者筋mRANによってコ-ドされる筋PFK酵素には25アミノ酸残基の欠失を有することが示され、さらにこの欠失は、患者ゲノムのスプライス・ドナ-部位のpoint mutationに起因するスプライシング異常から生ずるメカニズムを同定した。
以上から、本年度の研究業績は、本研究の究極の目的である筋PFK欠損症の遺伝子レベルの異常解明を現実のものとなし得た点で、重要な意味を有するのみならず、グリコ-ゲン病への分子生物学導入という観点からも、その先駆的な研究として今后の同種の研究を刺激しうるものである。

研究成果

• [文献書誌] H.Nakajima: "Evidence for alternative RNA splicing and possible alternative promoters in the human muscle phosphofructokinase gene at the 5'untranslated region." Biochem.Biophys.Res.Commun.166. 637-641 (1990)
• [文献書誌] H.Nakajima: "Genetic defect in muscle phosphofructokinase deficiency-abnormal splicing of the muscle phosphofructokinase gene due to a point mutation at the 5'splice site." Submitted to J.Biol.Chem.
• [文献書誌] T.Yamasaki: "Human muscle phosphofructokinase gene-structure and two promoter system." submitted to J.Biol.Chem.
• [文献書誌] H.Nakajima: "Molecular aspect of myogenic hyperuricemia:cloning of human muscle phosphofructokinase cDAN" Pruine and pyrimidine Metabolism in Man VI.Part A:Clinical and Molecular Biology.K.Mikanagi,K.Nishioka,W.N.Kelley eds.,Plenum Publishing,N.Y.and London. 485-491 (1989)
• [文献書誌] N.Hara: "Myogenic hyperuricemia:a comparative study between type V and type VII glycogenosis." Purine and pyrimidine Metabolism in Man VI.Part A:Clinical and Molecular Biology.K.Mikanagi,K.Nishioka,W.N.Kelley eds.,Plenum Publishing,N.Y.and London. 381-385 (1989)
• [文献書誌] I.Mineo: "Glucose infusion abolishes the excessive ATP degradation in working muscles of a patient with McArdle Disease." Muslce Nerve.
• [文献書誌] N.kono: "Inherited Metabolic Disease.Diagnosis and Treatment(Muscle glycogenoses.)" J.Fernandes,E.Bremer,J.M.Sandubray eds.,Springer-Verlage,Heiderberg,
• [文献書誌] N.Kono: "Inherited Metabolic Disease.Diagnosis and Treatment(The exercise test.)" J.Fernandes,E.Bremer,J.M.Saudubray eds.,Springer-Verlag,Heiderberg,