| 研究課題/領域番号 |
63470116
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
高橋 信孝 東京大学, 農学部, 教授 (10011826)
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| 研究分担者 |
山根 久和 東京大学, 農学部, 助手 (80090520)
山口 五十麿 東京大学, 農学部, 助手 (00012013)
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| キーワード | ジベレリン / 結合蛋白 / アフィニティークロマトグラフィー / イムノアッセ イ |
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| 研究概要 |
矮性インゲン(Phaseolus vulgaris cv.Mantle)を材料として、ジベレリン結合蛋白の抽出、精製法について検討した。材料は、自然光下、圃場にて播種、発芽させた1-3週間目の生長点部分を採取し、直ちに液体窒素で凍結したものと、ベーミキュライトに播種し、暗黒下25度で2週間生育・徒長させ、その生長点を凍結されたものを用いた。材料をトリス緩衝液で抽出した後、10,000gで遠心分離した後、トリチウム標識したGA1を用いて結合蛋白の検索を行ったところ、何れの材料にもGA1に結合する蛋白が、可溶性画分と沈澱の双方に存在することがわかった。以後の蛋白の精製の難易度を考慮し、暗黒下で生育させた材料を用いることとし、現在約3kgの材料を準備している。第一次の本格的な単離操作を、まもなく、5kgの材料が準備でき次第開始する。
一方、ジベレリン結合蛋白の精製については、その過程で最も重要なステップと考えているアフィニティークロマトグラフィーについて、抗GA1抗体をモデルとして、実験条件の設定を行うとともに、少量の植物材料を用いて、その有効性の確認をおこなった。その結果、リガンドのジベレリンと担体のゲルの間には少なくとも、炭素数5個以上のスペーサーを挿入する方が、効果的であること、植物の抽出液の中には、非特異的に、かつ、不可逆的にアフィニティーゲルに吸着されるものが無視できない程度に含まれている可能性が示唆された。そこで、ジベレリン結合蛋白に親和性を示さないプレカラム用のゲルの調製を行っている。また、以上の実験を行う過程で、抗GA1、GA4抗体を用いたELISAが結合蛋白の検出に有効であることが示された。
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