マイケル付加タイプ不斉合成反応を触媒する酵素の構造-機能相関の研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63470136
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 徳重 正信 京都大学, 理学部 (20025266)
• 研究分担者: 湯元 昇 京都大学, 理学部, 助手 (30200877)
• キーワード: マイケル付加 / アスパルタ-ゼ / フラマ-ゼ / 不斉合成反応 / 相同性 / ハイブリッド化 / 部位指向遺伝子変異 / 鉄-硫黄クラスタ-

研究概要

アスパルタ-ゼとフマラ-ゼは共にフマル酸を基質としてマイケル付加タイプの反応を触媒する酵素であり、アミノ酸配列のみならず反応機構に高い相同性が示唆されているが、その詳細は不明である。そこで、本研究では両酵素の構造と機能発現の機作を研究し、以下の結果を得た。
1.可逆的変性を利用して四重体酵素であるアスパルタ-ゼの分子中に2-3個の失活サブユニットを含むハイプリッド酵素を調整したところ、ネイティブサブユニットの数に比例した活性を示した。また、ハイプリット化に伴い協同性が著しく減少することを見いだした。
2.アスバラギン酸β-セミアルデヒドがアスパルタ-ゼに対して親和性修飾剤として作用することを我々は以前に報告した。本修飾剤の作用機作を明らかにするために、本修飾剤の酵素的合成に必要なホモセリン脱水素酵素をパン酵母より迅速均一精製することに成功した。
3.アスパルタ-ゼの基質結合部位近傍に生存することが予想されるシスティン-430をトリプトファン残基に変換した酵素の調整を昨年度報告したが、本酵素の均一精製を達成し酵素学的性質を検討したところ、酸性pHにおいて活性が野生型酵素の約4倍に増強されていることを見いだした。またこの変換に伴い、活性の二価金属要求性が顕著に増大した。
4.大腸菌W株アスパルタ-ゼ遺伝子をpSUIに組み込んだプラスミドを用いて本酵素欠損株である大腸菌TK237を形質転換し、本酵素の大量発現系を確立し、結晶化にむけての本酵素の大量調整が可能になった。
5.大腸菌のフマラ-ゼの中で活性発現に二価鉄イオンを要求するこれまでに知られていないタイプの酵素の均一精製に成功し、本酵素が三つのフマラ-ゼ遺伝子の中のfumA遺伝子の物産であることを明らかにした。また、本酵素の酵素学的性質を検討したところ、本酵素がアコニタ-ゼみられるような鉄-硫黄クラスタ-構造を持つところが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Hiromasa Imaishi: "Preparation of active hybrid enzymes composed of the native and chemically insctivated aspartase subunits from Escherichio coli" Biotrchnology and Applied Biochem. 12. (1990)
• [文献書誌] Hiromasa Imaishi: "Charactorizction of intermediate species during the moleculor assemly of aspartase" Physiol Chem.Phys.Med.NMR.(1990)
• [文献書誌] Noboru Yumoto: "Rapid punification and characterization of homoserine dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae" Eur J.Biochem. (1990)
• [文献書誌] Noboru Yumoto: "Characterization of multiple fumarase proteins in Escheri chio coli" Biochem.Biophys.Res.Commun. 153. 1236-1243 (1988)
• [文献書誌] Yuji Ueda: "Punfication and characterization of two types of fumarase from Escherichia coli" J.Biol.Chem. (1990)
• [文献書誌] Noboru Yumoto: "Site-directed mutagenesis of Cys-430 to Trp-430 of aspartase" (1990)
• [文献書誌] 徳重正信: "酵素のはたらき" 東大出版会, 123 (1989)
• [文献書誌] 徳重正信偏著: "(株)さんえい出版" 生命の化学最前線, 165 (1990)