時間分解紫外共鳴ラマン分光法によるタンパク質の動的構造の解析

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63470141
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 北川 禎三 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 教授 (40029955)
• 研究分担者: 小倉 尚志 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 助手 (70183770)
• キーワード: 共鳴ラマン散乱 / ヘモグロビン / タンパク質高次構造 / 時間分解ラマン分光 / 紫外共鳴ラマン

研究概要

いろいろなタンパク質の静的構造がX線結晶解析により明らかにされ、分子の構造と機能を考える基礎を与えてきた。しかし機能の発現にはタンパク質のやわらかさが必須であり、動的構造の解明が重要である。振動スペクトルは分子構造に敏感で時間応答が早いため、反応中間体等の短寿命分子の構造研究に適しているが、感度が低くシグナルの選択性に問題があった。しかし柴外光を励起光とする共鳴ラマン散乱を用いると、芳香族アミノ酸残基の分子振動を選択的に感度高く検出できることが明らかになってきた。そこで本研究では、200〜240nm励起の共鳴ラマンスペクトルを10nsの時間分解能で観測できる実験系をつくり、それで一酸化炭素ヘモグロビンの光解離に伴う4次構造変化を追跡した。Nd:YAGレ-ザ-の4倍波を長さ1mのH_2ラマンシフタ-でシフトさせ、ペランブロッカプリズムで218nmの光を単離してラマン散乱の光源とした。1.26mの分光器に2400gr/mmの回折格子をつけ、それを2次で使用した。COの光解離にはN_2レ-ザ-励起の色素レ-ザ-で419nm、10nsのパルス光を発振させた。パルス発生器でNd:YAGレ-ザ-点火時刻をN_2レ-ザ-のそれよりマイクロ秒のオ-ダ-で遅延させた。+1秒の遅延に対しては、N_2レ-ザ-の代りにNd:YAGレ-ザ-の2倍波をラマンシフトさせた436nmのパルスを光解離に用い、光路差で遅延時間(△t)を変えた。(△t)が-100μsと+10nsのスペクトルは同じであったが、△t=10〜20μsのところからトリプトファンの878cm^<-1>のラマン線が883cm^<-1>にシフトし始め〜50μsで一定値に達した。試料室がCOガス雰囲気では〜100μs後に元に戻った。これと同様のスペクトル変化は、メトヘモグロビンのIHPを添加して4次構造を変えた時にも観測された。それ故、上に観測した時間変化はα1ーβ2界面にあるβ37トリプトファンが4次構造変化により状態変化したために現われたと解釈した。ヘムの構造変化がサブユニット界面に伝達されるのに10μs要することが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] S.Kaminaka,T.Ogura,T.Kitagawa: "Time-resolved Ultraviolet Resonance Raman Study of the Photolysis of Carbonmonoxy Hemoglobin:Relaxation of the Globin Structure." Journal of the American Chemical Society. 112. 23-27 (1990)
• [文献書誌] T.Ogura,S.Yoshikawa,T.Kitagawa: "Raman/Absorption Simultaneous Measurements for Cytochrome Oxidase Compound A at Room Temperature with a Novel Flow Apparatus." Biochemistry. 28. 8022-8027 (1989)
• [文献書誌] A.L.Verma,K.Kimura,T.Yagi,A.Nakamura,H.Inokuchi,T.Kitagawa: "SERR Evidence for Enzymic Reduction of Cytochrome C_3 Adsorbed on Ag Colloids." Chemical Physics Letters. 159. 189-192 (1989)
• [文献書誌] S.Hashimoto,T.Kotani,R.Nakajima,S.Ohtaki,I.Yamazaki,T.Kitagawa: "Resonance Raman Characterization of Hog Thyroid Peroxidase:A SERRS Study." FEBS Letters. 248. 205-209 (1989)
• [文献書誌] Y.Ozaki,K.Aoyagi,K.Iriyama,H.Ogoshi,T.Kitagawa: "Resonance Raman Characteristics of NーMethy1ーOctaethylporphyrinatoーcobalt(II)." Journal of the Physical Chemistry. 93. 3842-3847 (1989)
• [文献書誌] M.Nagai,Y.Yoneyama,T.Kitagawa: "Characteristics in Tyrosine Coordinations of Four Hemoglobins M Probed by Resonance Raman Spectroscopy." Biochemistry. 28. 2418-2422 (1989)
• [文献書誌] 北川禎三(他): "新生化学実験講座" 東京化学同人, (1990)