| 研究課題/領域番号 |
63480127
|
|---|
| 研究機関 | 山口大学 |
|---|
研究代表者 |
中澤 淳 山口大学, 医学部, 教授 (90025594)
|
|---|
| 研究分担者 |
山田 守 山口大学, 医学部, 助手 (30174741)
井上 幸江 山口大学, 医学部, 助手 (60159978)
|
|---|
| キーワード | アデニレートキナーゼ / アイソザイム / cDNA / 代謝調節 / 高温致死変異 |
|---|
| 研究概要 |
糖代謝をはじめとするエネルギー生産経路においてはAMPが代謝調節因子として重要な意味をもつことが多い。このAMPの供給にはアデニレートキナーゼが寄与すると考えられる。本酵素には細胞質型(AK1)、ミトコンドリア膜間型(AK2)、ミトコンドリアマトリックス型(AK3)の3種のアイソザイムが存在するが、このような細胞内局在の違いがどのような代謝調節上の意味をもつかは不明である。
本研究では、CHO細胞で高温感受性アデニレートキナーゼ変異株を分離し、これにアデニレートキナーゼアイソザイムcDNAを発現ベクターにつなぎ導入した上で、形質転換細胞についてその代謝調節機能を解析することを目指すものである。
我々は既に3種のアイソザイムのcDNAを分離していたが、この中にAK3についてはなお次のような問題があることに気付いたので検討を行った。AK3 cDNAのクローンではN未端と考えられるメチオニンのコドンの上流になおコード枠が続くので、本cDNAが完全長ではないことも考えられた。今回、5′側上流を大きく含むcDNAクローンを改めて分離したところ、ATGの上流に9塩基のところに停止コドンが存在することがわかり、これまで我々が同定していたコード領域が正しいことが明らかになった。次CHO細胞に導入すべきAK1、AK2、AK3のコード領域を発現ベクターpCDL1につなぎ込んだ。また、細胞エレクトロポレーションシステム、ジーンパルサー(バイオラド)を購入し、pSVZnecを利用してCHO細胞へのDNA導入の予備的検討を行った。さらに、ジーンパルサーを大腸菌HBI01へのプラスミドDNA導入に利用し、従来のカルシウムー熱パルス法と比較し、ほぼ同じ効率で簡便にDNA導入が行えることを確かめた。
|
