| 研究課題/領域番号 |
63480139
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
中根 一穂 東海大学, 医学部, 教授 (60164240)
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| 研究分担者 |
小路 武彦 東海大学, 医学部, 助手 (30170179)
森内 哲也 東海大学, 医学部, 講師 (20174394)
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| キーワード | DNA損傷 / DNA修復 / 細胞分化 / Nick Translation / PCNA / 紫外線 |
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| 研究概要 |
1)核内DNAニックの検出方法の確立:個々の細胞に於けるニックの局在証明に先立って、ニトロセルロースフィルター上でDNAに生じたニック検出に必要な至適条件の検討を行なった。a)lambda DNAを種々の濃度のDNase Iで消化してニックを形成させた後、biotin-11-dUTPを基質としてE.coliのpolymerase Iによるnick translationを溶液中で行なわせ、後DNAをニトロセルロースフィルターに焼き付けbiotinに対するペルオキシダーゼ標識抗体を用いて免疫組織化学的にニックの検出を行なった。その結果、スポット当たり10 ngのDNAでbiotin化DNAに特異的に又DNase Iの濃度に依存した(0.001-0.1ug/ml)強い呈色を得た。b)ニトロセルロースフィルター上でも溶液中と同様にnick translationが可能であることを確認するため、種々の濃度のDNase Iで消化したlambda DNAをニトロセルロースフィルターに焼き付け、後nick translationを行なった。その結果、1)と同様に特異的シグナルを検出すると共に、更に、至適反応条件はpolymerase Iの濃度は200units/mlで37℃、3hrsであった。特にこの温度では、polymeraseIのsnap back反応がおこるため、ニックの検出感度を高めることが出来た。
2)核内DNAニックの分布:PCNA遺伝子は増殖期にあるHL60細胞では発現しているが、この細胞にDMSOを付加すると顆粒球に分化して増殖が停止し、PCNA遺伝子が発現しなくなる事を先ず確認した。この系で、PCNA遺伝子が発現されない状態では紫外線照射でも発現されないとの結果を得た。この事から核内でのPCNA遺伝子の状態が細胞分化に伴い変化したと考えられるので、この状態で紫外線照射によりPCNA遺伝子に形成させたチミンダイマーは修復されるかを検討中である。
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