多発性筋炎における筋崩壊機構の解明と治療法の開発

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63480219
• 研究機関: 国立精神・神経センター
• 研究代表者: 杉田 秀夫 国立精神・神経センター, 神経研究所, 所長 (80009951)
• 研究分担者: 塚原 俊文 国立精神, 神経センター・神経研究所・疾病研究第一部, 研究員 (60207339) ; 石浦 章一 国立精神, 神経センター・神経研究所・疾病研究第一部, 室長 (10158743) ; 荒畑 喜一 国立精神, 神経センター・神経研究所・疾病研究第一部, 室長 (30053325)
• キーワード: 多発性筋炎 / パ-フォリン

研究概要

多発性筋炎における骨格筋崩壊機構を解明するために本疾患に特異的浸潤細胞である細胞障害性Tーリンパ球(CTL)に注目した。CTL中に存在する膜障害性タンパク質パ-フォリン及びタンパク分解酵素を抽出し、その物理化学的、細胞生物学的特性を検索して来たが、本年度はヒト血清がパ-フォリン活性を強く抑制する事を見出しこの抑制物質の抽出を試みた。
血清中に存在するパ-フォリン活性抑制物質の抽出
四名の健康成人男子から調整したヒト血清20mlを5mMPB(pH7.0)により透析したのち、30mlのDEAEセルロ-スカラムにアプライしNaCl直線濃度勾配にてタンパク質の溶出を行うと、パ-フォリン活性阻害タンパク質はNaCl0.5〜1.5Mにて溶出された。この活性分画を5mMPBにて透析したのち、固型硫酸アンモニウムを加えてタンパク沈澱を行うと活性阻害タンパク質は硫酸アンモニウム30g/dlにより沈澱することが明らかとなった。この活性分画をHPLCゲルろ過(TSKーG3000SW)カラムにアプライすると活性阻害タンパク質は素通り分画(分子量約500KD)に得られた。更にこの活性分画を5mMPBによ透析したのち10mlのHydroxylapatiteカラムにアプライし、5mM〜0.5MPBによるStepーwise gradientで溶出すると、インヒビタ-活性タンパク質は0.3MPBにより溶出された。以上の過程によりSDSゲル電気泳動上分子量約500KDのパ-フォリン活性阻害タンパク質が精製された。このインヒビタ-タンパク質についてパ-フォリンの膜結合および細胞傷害作用におよぼす影響を検討したところ、このインタヒビタ-タンパク質は主としてパ-フォリンの膜結合過程を抑制することが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Shoichi Ishiura,Kiyoshi Matsuda,Hirotaka Koisumi,Toshifumi Tsukahara,Kiichi Arahata and Hideo Sugita: "Calcium is essential for both the membrane binding and lytic activity of pore-forming protein(perforin)from cytotoxic T-Lymphocyte" Molecular Immunology. (1990)
• [文献書誌] Shoichi Ishiura,Toshifumi Tsukahara,Hirotaka Koizumi,Kiichi Arahata and Hideo Sugita(Ed.N.Katsunuma and E.Kominami): "Cytotoxic molecules,perforin and serine esterases in cytotoxic T-Lymphocyte.“Intracellular proteolysis.Mechanisms and Regulations"" Japan Scientific Societies Press, 7 (1989)