| 研究課題/領域番号 |
63480268
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教授 (40135380)
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| 研究分担者 |
松井 信夫 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (50023643)
村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (80174308)
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| キーワード | サイロキシン結合グロブリン / 部位特異的突然変異 / トランスフェクション / 糖鎖 |
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| 研究概要 |
1.表現ベクタ-に挿入したTBG構造遺伝子の作成:TBG遺伝子を効率よく動物細胞に発現させるためには、ゲノム遺伝子を直接動物細胞に導入するより、強力なプロモタ-の下流にTBGの構造遺伝子を組み込んだ組替え体を導入した方が良いと考えられたため、TBGの構造遺伝子を作成した。即ち、我々が既にクロ-ニングしたTBG cDNAに不足する部分を、ゲノムクロ-ンのエキソンを用いて補い、構造遺伝子を作成した。作成した構造遺伝子は、真核細胞発現ベクタ-pSV2に挿入し、キメラプラスミドを作成した。
2.発現ベクタ-に挿入した異常TBG遺伝子(TBG-Gary)の構造遺伝子の作成:1の如く作成した正常TBG構造遺伝子の一部を異常TBG(TBG-Gary)のゲノム遺伝子の突然変異を含むエキソンの一部と置換し、TBG Gary構造遺伝子を作成、上述の如くpSV2に挿入した。
3.正常並びに異常TBG遺伝子のCOS1細胞への導入と産物の解析:1の如く作成した正常TBG構造遺伝子をCOS1細胞にDEAE-dextran法にて導入した。^<35>S-メチオニンを用いたパルスラベル法により、遺伝子の導入が、ヒトTBGの合成・分泌をもたらすことを確認した。しかしながら遺伝子の導入効率が悪いため、産生されるTBGの物理化学的性状を検討することは困難であった。リポフェクションを遺伝子導入法として用いた場合、DEAE-dextran法に比し、10倍以上のTBG産生を得、産生されたTBGの生物学的活性を等電点電気泳動を用いて確認することが出来た。次年度にはTBG-Gary遺伝子の導入により、TBG分子内の異常糖鎖が生物学的活性、安定性等にどの様に影響するかを検討すると共に、糖鎖負荷部位をコ-ドする塩基配列の部位特異的突然変異法を用いて糖鎖の役割を更に研究する。
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