| 研究課題/領域番号 |
63480268
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教授 (40135380)
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| 研究分担者 |
松井 信夫 名古屋大学環境医学研究所, 教授 (50023643)
村田 善晴 名古屋大学環境医学研究所, 助手 (80174308)
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| キーワード | サイロキシン結合グロブリン / 部位特異的突然変異 / トランスフェクション / 糖鎖 |
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| 研究概要 |
1.糖鎖付加異常の存在すると考えられる異常TBG症(TBGーGary)の発症機序の研究:昨年の研究で得られたTBGーGaryの構造遺伝子を発現ベクタ-pEUKーC1に挿入し、COS1細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を35Sーメチオニンを用いて、パルス-チェイスすることにより、TBGーGaryの合成分解過程を詳細に検討した結果、TBGーGaryには新たな糖鎖が付加されていること、サイロキシン(T4)結合能が低下していること、著しい分泌障害のあること、細胞内の分解を受け易いことなどが明らかにされた。
2.部位特異的突然変異作成法(Site Specific Mutagenesis)を用いた変異TBG遺伝子の作成:部位特異的突然変位作成法はM13バクテリオファ-ジのreplicative formにTBGの構造遺伝子を挿入し、これを用いてトランスフォ-ムした大腸菌から放出される単鎖のウィルスDNAを鋳型とし、合成オリゴヌクレオチドを用いて、TBG遺伝子の糖鎖付加部位をコ-ドする核酸配列に塩基置換を導入した。
3.Site Specific Mutagenesisにより作成された変異TBG遺伝子の動物細胞における発現の検討:作成された変異TBG遺伝子(TBGーGaryの異常糖鎖付加部位のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した遺伝子)を発現ベクタ-pEUKーC1に組み込み、COS1細胞に導入した。変異遺伝子を導入した細胞を放射性アミノ酸の存在下でインキュベ-トし、合成されたTBGを抗体を用いて沈澱し種々の電気泳動法により解析した。この結果、TBGーGaryのT4結合能の低下、並びに合成・分泌の異常が、新たな糖鎖付加により生じることが明らかにされた。
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