生物反応修飾物質(BRM)で誘導される腫瘍壊死因子(TNF)産生細胞の遺伝子工学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63480303
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 森 武貞 大阪大学, 医学部, 教授 (60028496)
• 研究分担者: 室谷 昌弘 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 ; 森元 秀起 大阪大学, 医学部, 助手 (70220085) ; 島野 高志 大阪大学, 医学部, 講師 (80144476) ; 門田 卓士 大阪大学, 医学部, 助手 (20174477)
• キーワード: 生物反応修飾物質 / 腫瘍壊死因子 / 免疫染色 / in situ hybridization

研究概要

大腸癌担癌局所における癌と宿主の免疫応答を解析するため、cytokine mRNAをタ-ゲットとするin situ hybridization法を試みた。まずTumor necrosis factor(TNF)mRNAを検出するためにTNFのcDNA probe(476bp、全塩基配列)を人工的に合成した。pennicaらの報告したTNF cDNAの塩基配列をもとに、全体を6個のブロックに分割した人工遺伝子を作製。各ブロックを独立にpUc18にサブクロ-ニングしたのち、おのおのをDNA ligaseで順次連結して目的とする476bpのTNF cDNAをえた。このprobeをスルホン化し、BRMの1種であるOKー432で活性化させたヒト末梢血単核球のマイクロウエ-ブ固定標本を対象にTNF mRNAの検出を行ったところ、刺激後12ー24時間の単核球の細胞質にTNF mRNAが検出された。この細胞の培養上清中のTNF活性をEIA法で経時的に測定したところ、in situ hybridizationでTNF mRNAが検出された時間に一致して、TNF活性のピ-クが認められた。また、その細胞標本をTNFに対する抗体で免疫染色したところ、刺激後1.5時間で核陥凹部に一致した細胞質にTNFの免疫反応が出現し、3、6、12、24時間と培養するにつれて細胞質の反応が増強し、EIA法による培養上清中のTNF値変動と非常によく一致した。また、同時に行なったILー1αおよびILー1βの免疫染色では、EIA法でピ-クの値をとる刺激後6時間目の単核球の細胞膜にILー1α、細胞質内にILー1βの強い免疫反応が得られた。以上の結果から、TNF、ILー1αおよびILー1βの検出には、マイクロウエ-ブ照射による迅速固定法がもっとも適していると考えられた。次に、ヒト大腸癌組織のマイクロウエ-ブ固定パラフィン切片を対象に、癌巣に浸潤する単核球中のTNF mRNAの検出を試みたが、まだ明らかな陽性所見が得られるには至っていない。そこで、OKー432を術前に腫瘍内投与し、cytokineの産生を誘導することを試みたところ、投与法を工夫することによって効率的なcytokine産生がおこる可能性が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] M.MUROTANI: "Application of microwave(MW)-fixed tissue samples to in situ hybridization:Detection of carcinoembryonic antigen(CEA)mRNA and oncogene transcripts in MW-fixed colorectal carcinomas using sulfonated probes." Acta Histochem.Cytochem.(1990)
• [文献書誌] T.MONDEN: "Use of a rapid microwave fixation technique for immunocytochemical demonstration of tumor necrosis factor,interleukin-la,and interleukin-lb in activated human peripheral mononuclear cells." Acta Histochem.Cytochem.(1990)
• [文献書誌] M.HIGASHIYAMA: "Immunohistochemical study on pancreatic secretory trypsin inhibitor(PSTI)in gastric carcinomas" Am.J.Clin.Pathol.93. 8-13 (1990)
• [文献書誌] T.YANO: "Detection of carcinoembryonic antigen,intestinal mucus antigen,and gastric mucus antigen in adenocarcinomas associated with Barrett's esophagus" Diseases of the Esophagus. 551-554 (1988)
• [文献書誌] T.MONDEN: "In situ detection of Ha-ras and c-myc mRNA in cancer cell lines and tissue sections of colorectal cancer using sulfonated DNA probes." Acta Histochem Cytochem.21(2). 201-209 (1988)
• [文献書誌] 春名伸彦: "OKー432のTNF,ILー1α,およびILー1β誘導能ーEIA,ならびに免疫染色による解析" Biotherapy.3(5). 1347-1350 (1989)
• [文献書誌] T.MONDEN: "The carcinoembryonic gene family" Elsevier Science Publishers BV., 111-118 (1989)
• [文献書誌] 門田卓士: "癌の臨床" 篠原出版, 127-136 (1989)