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出発材料として、当初、ラットの歯髄を取り出しホモジナイズ後、ショ糖密度勾配遠心を行ったが、有髄神経の絶対量が少なすぎ、ミエリン画分を得ることができなかった。そこで、ラットの腋窩、筋皮、正中、橈骨、尺骨、座骨の各神経をホモジナイズ後、ショ糖密度勾配遠心を行ったところ、6匹のラットからでも界面に明瞭なミエリン画分を得ることができた。ショ糖密度勾配遠心は、浮上法と沈降法を比較検討したが沈降法の方が、より顕著にミエリン画分を得ることができた。
密度勾配遠心にて得られたミエリン画分を、低張処理したのち遠心し沈澱物の純度を検討するため、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果この沈澱物は、層板状構造をとるミエリンからなっていることが確認できた。
粗ミエリン画分は、酸不溶性分画、脱脂操作を行ったのち、Sephacryl S-100カラムでゲル濾過したところ、1つの大きなピ-クを得ることができた。このピ-クに相当するフラクション約20μlを、SDSを含むポリアクリルアミドスラブゲルで電気泳動を行っても、蛋白量が少なすぎ、ク-マシ-ブル-染色にてバンドを検出することができなかった。次にこのフラクションを、アミコンのセントリプレップ-10を用いて約12倍に濃縮し、同様に電気泳動したところ、ク-マシ-ブル-、PAS染色にて約32KDの位置に単一のバンドが確認できた。
ゲル濾過、電気泳動の結果から、今回、分離・精製されたミエリン蛋白は、PO糖蛋白と結論でき、今後は、ゲル濾過後の濃縮サンプルを直接抗原として、in vitro法によるモノクロナル抗体を作製し、歯髄疾患時の歯髄神経の変性・再生現象を検討していきたいと考えている。
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