オピオイドレセプタ-精製とそのモノクロ-ナル抗体の作成および応用

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63480464
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 佐藤 公道 京都大学, 薬学部, 教授 (80025709)
• 研究分担者: 植田 弘師 京都大学, 薬学部, 助手 (00145674) ; 倉石 泰 京都大学, 薬学部, 助教授 (80111970)
• キーワード: オピオイドセレプタ- / モノクロ-ナル抗体 / NG108-15細胞 / 情報伝達機構

研究概要

薬理学的研究から、オピオイドレセプタ-は、μ-、δ-、κ-サブタイプに分類され、それぞれが異なったin vivo,あるいは、in vitroの薬理活性と連関していることが報告されている。しかし、この様な薬理作用の基礎にある個々のレセプタ-サブタイプの性状については殆ど明らかにされていない、本研究は、各種サブタイプのオピオイドレセプタ-の一次構造の解析およびその蛋白分子レベルでの情報伝達機構の解明を目的とし、それらのモノクロ-ナル抗体の作成を試みた、多くの検討の結果、δ-オピオイドレセプタ-を高濃度含むNG108-15細胞膜をそのまま免疫したものをミエロ-マ細胞と融合したハイブリド-マのうち、少なくとも2つの異なる性質の抗体活性を示すクロ-ンが得られた。一つのクロ-ンから得られた、モノクロ-ナル抗体δ-OpR-1はδ-オピオイドアゴニスト結合をそのBmaxを減少させる様式で阻害し、またアゴニストによるアデニレ-トシクラ-ゼ活性の抑制にも拮抗した。従って、δ-OpRはδ-レセプタ-に競合的拮抗作用を有する抗体であることが明らかとなった。他のクロ-ンから得られたモノクロ-ナル抗体δ-OpR-3はδ-レセプタ-のアゴニスト結合部位というよりも、むしろ少し離れた部位を確認し、レセプタ-のアゴニスト親和性を低下させた。また、免疫組織化学的実験において、アセトンやPFA処理したセレプタ-をも認識できたことから、立体構造を確認しているというよりも、むしろ特定のアミノ酸配列を認識するということが明らかとなった。レセプタ-結合実験や免疫組織化学の実験から、この抗体はδ-オピオイドレセプタ-を特異的に認識していることが明らかになったことから、今後脳組織などのδ-レセプタ-のマッピングなどに利用できるものと考えられる。現在我々はこれらのモノクロ-ナル抗体を用いて、δ-レセプタ-の精製及び発現クロ-ニングの研究を進めており、この情報伝達機構の解明を急いでいるところである。

研究成果

• [文献書誌] Ueda,H.,Harada,H.,Nozaki,M.,Katada,T.,Ui,M.,Satoh,M.and Takagi,H.: "Reconstitution of rat brain μ-opioid receptors with puriqiod guanine nucleotide-binding reguletory proreins, Gi and Go." Proc,Natl.Acad.Sci.USA. 85. 7013-7017 (1988)
• [文献書誌] Harada,H.,Ueda,H.,Katada T.,Ui,M. and Satoh,M.: "Phosphorylation of μ-opioid receptor 2 putative rnecharism of selective uncoupling of receptor-Gi intoracton,measured with low-KmGTPase and guanine nucle otide-sensitive binding" Neurosci,Lett.100. 221-226 (1989)
• [文献書誌] Ueda,H.,Misawa,H.,Kafada,T.,Ui,M.,Takagi,H,and Satoh, M.: "Functional reconstitution of purified Gi and Go voith μ-opioid receptors in guineapig striatal membranes pre-treated with micromolar concentrations of N-ethylmaleimide" J.Neurocham. (1990)
• [文献書誌] 植田弘師、佐藤公道: "オピオイドレセプタ-とGTP結合蛋白の再構成" 生物物理. 29. 8-12 (1989)
• [文献書誌] 植田弘師: "オピオイドレセプタ-機構の分子薬理学" 日本薬理学雑誌. 94. 339-349 (1989)
• [文献書誌] 植田弘師、西村和洋、石田久美子、宇野彰一、佐藤公道: "δ-オピオイドレセプタ-のモノクロ-ナル抗体作製" 生化学. 61. 930 (1989)
• [文献書誌] Ueda,H.,and Satoh,M.: "μ-Opioid Receptor-Purification and Reconstitution with GTP-Binding Protein.In:Receptor Purification" Humana Press,Clifton, 16 (1990)
• [文献書誌] Ueda,H.,Nozki,M.and Satoh,M.: "Multiple Opioid Receptors and GTP-binding Proteins" Comparative Biochemistry and Physiology,Pergamon Press,oxford, (1990)