| 研究課題/領域番号 |
63480490
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
井上 圭三 東京大学, 薬学部, 教授 (30072937)
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| 研究分担者 |
新井 洋由 東京大学, 薬学部, 助手 (40167987)
梅田 真郷 東京大学, 薬学部, 助手 (10185069)
工藤 一郎 東京大学, 薬学部, 助教授 (30134612)
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| キーワード | ウサギ血小板 / ヒト血小板 / アラキドン酸代謝 / カルシウムイオン / ホスホリパ-ゼA_2 / モノクロ-ナル抗体 |
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| 研究概要 |
(1)ウサギ血小板アラキドン酸高親和性ホスホリパ-ゼA2の部分精製標品をニトロセルロ-ス紙に吸着させ、脾臓内に注入することに依ってマウスを免疫した。2次免疫後、常法に従ってハイブリド-マを作製した。得られたハイブリド-マの培養上清を一定量とり、ホスホリパ-ゼA2のアッセイに加え、ビ-ズに固定された2次抗体を添加して、酵素活性の吸収を指標に、特異的ハイブリド-マをスクリ-ニングした。その結果、加える培養上清の容量に依存して酵素活性に影響を与える株を4株を得、クロ-ン化した。いずれもIgM抗体を産生し、ウサギ血小板の酵素以外に、ヒト血小板の酵素とも交叉性を示した。また、脳、肺、肝臓のホスホリパ-ゼA2活性が交叉性を示した。しかし、ウサギ血小板が刺激に応じて放出する14kDaグル-プII型酵素とは反応しなかった。ウエスタンブロット解析で、特異抗体は確かに抗原である約90kDaのタンパクと結合した。
(2)ヒト血小板の可溶性画分から、アラキドン酸含有基質に高い親和性を持つホスホリパ-ゼA2を、単一標品にまで精製した。精製酵素は分子量約90kDaであり、リノ-ル酸含有基質に比べてアラキドン酸含有基質を非常に効率よく加水分解した。ホスファチジルコリンを基質にした活性は、遊離カルシウムイオン濃度が0.3マイクロモルではほとんど検出できないが、1マイクロモルにまで上昇すると、ほぼ100%の活性を発揮することがわかった。
(3)まとめ:本研究では、ウサギとヒト血小板から分子量約90キロダルトンの酵素学的にも、免疫化学的にも新しいタイプのホスホリパ-ゼA2を精製した。今回精製したホスホリパ-ゼA2は、そのカルシウムイオン要求性と脂肪酸選択性から判断して、おそらく刺激連関にカップルしたアラキドン酸代謝に密接に関わっている酵素であると考えられる。
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