チャ-ジリンーその三次構造の解明とエネルギ-変換機作の研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63480502
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 樋口 富彦 徳島大学, 薬学部, 助教授 (50035557)
• キーワード: ミトコンドリア / ミトコンドリアDNA / エネルギ-変換 / チャ-ジリン / ATP合成酵素 / プロトンポンプ / サブユニットb / バイオジェネシス

研究概要

本年度は、主として以下の成果を得ることに成功した。
1. 筆者らが、以前発見した異方性阻害剤を用いた解析から、H^+輸送性ー電子伝達複合体とATP合成酵素は、各々の複合体のCー側が負、Mー側が正の表面電位を発生した“酵素複合体内電場"(いわば、微小平行板コンデンサ-の充電状態)が形成されたエネルギ-化状態が存在することを初めて立証した。
2. 抗チャ-ジリンIIC末端抗体と[^<125>I]-proteinAを用いたドット法によるラジオイムノアッセイを行い、チャ-ジリンII精製標品による検量線を作製し、ATP合成酵素および亜ミトコンドリア粒子中のチャ-ジリンII含量を定量した。その結果、チャ-ジリンIIは、ミトコンドリアにおいてATP合成酵素のみに、そのF_0のサブユニットの一つとして、本酵素と等モル数存在していることがはじめて明らかとなった。この発見は、ミトコンドリアのH^+-ATP合成酵素のサブユニットのストイキオメトリ-が決定された最初の報告である。
3. H^+-ATPの合成酵素のサブユニットを逆相カラムを用いたHPLCにより高純度に精製後、プロテイン シ-クエンサ-(ABI、470A型)を用い、部分的なアミノ酸配列を決定した。ついで、これらのアミノ酸配列に対応するプロ-ブDNAを作製し、遺伝子操作の手法によりサブユニットのcDNAのクロ-ニングを行った。その結果、F_0サブユニットの一つであるsubunit bのcDNAは、1,124の矢基対すらなり、214個のアミノ酸配列からなる蛋白質をコ-ドしている領域が確認された。また、その上流には、42個のImport Precursor(ミトコンドリアへの輸送シグナルペプチド)のペプチドをコ-ドしていることが推測された。これは、subunit bのImport Precursorの配列が確認された最初の報告である。

研究成果

• [文献書誌] Higuti,T.: "A Hydrophobic Protein,Chargerin II,Purified from Rat Liver Mitochondria Is Encoded in the Unidentified Reading Frame A6L of Mitochondrial DNA." J.Biol.Chem.263. 6772-6776 (1988)
• [文献書誌] Oda,T.: "Orientation of Chargerin II(A6L)in the ATP synthase of Rat Liver Mitochondria Detemined with Antibodies against Peptides of the Protein." Biochem.Biophys.Res.Commun.165. 449-456 (1989)
• [文献書誌] Higuti,T.: "A Hydrophobic Protein,Chargerin II,Purified from Rat Liver Mitochondria Is Encoded in the Unidentified Reading Frame A6L of Mitochondrial DNA." In:Molecular Structure,Function and,and Assembly of ATP Synthases(S.Marzuki,ed.)Plenum Press. 271-277 (1990)
• [文献書誌] Muraguchi,M.: "Stoichiometry of Chargerin II(A6L)in the H^+-ATP Synthase of Rat Liver Mitochondria." Biochem.Biophys.Res.Commun.(1990)
• [文献書誌] Yoshihara,Y.: "H^+-ATP Synthase from Rat Liver Mitochondria.A Simple,Rapid Purification Method of The Functional Complex and Its Characterization." J.Biol.Chem.
• [文献書誌] Turumi,T.: "cDNA Sequence of the Import Precursor of the Subunit b of H^+-ATP Synthase from Rat Mitochondria." Biochemistry.
• [文献書誌] 樋口富彦: "生体膜における電子移動ーミトコンドリアを例としてー「バイオ素子開発と設計」赤池敏宏・品川嘉也編集" ミマツデ-タシステム, 34 (1989)
• [文献書誌] 樋口富彦: "ドットブロットとウエスタンブロット法「細胞・抗体・遺伝子の基礎実験法」ー蛋白質を中心として堀尾武一監修" 南江堂, (1990)