| 研究課題/領域番号 |
63480510
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
伊藤 建夫 大阪大学, 理学部, 助教授 (40051817)
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| 研究分担者 |
堀井 俊宏 大阪大学, 理学部, 助手 (80142305)
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| キーワード | コリシンE2 / コリシンE3 / 複製開始蛋白 / 複製開始部位 / プラスミド特異性 / 一方向複製 / プライマーRNA |
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| 研究概要 |
ColE2およびColE3DNA複製系を用いて、プラスミド特異的複製開始蛋白(Rep蛋白)によるDNA複製開始の分子機構の解明を試みた。分離用小型超遠心機(日立CS120)の購入・設置により、多種類のプラスミドDNAを極めて迅速に精製し得るようになった。以下に本年度の研究成果およびこれに関連した今後の研究の展開についての計画を記す。
1.相同組換えを利用して極めて効率良く多数のColE2とColE3のrep遺伝子のキメラを得た。Rep蛋白のプラスミド特異性は約50アミノ酸残基を含む領域内の残基により決定されていることが示唆された。さらにこの領域を限定し、特異性決定残基を固定することを試みている。
2.複製開始部位(Ori濃33塩基対)中の一ケ所の残基によりRep蛋白のOriにおける複製開始反応の特異性が決定されている。
3.試験管内コリシンE2DNA複製系における複製中間体を制限酵素で処理したものの解析から、複製が一定起点より一定方向に進行することを確認した。欠失変異および部位指定変異を利用して、複製の一方向性を決定している塩基対の決定を試みることを計画している。
4.試験管内複製系において、最初にOri付近から合成されるDNA断片を検出した。このDNA断片は複製方向に合成されるleading鎖成分であり、Ori内にその5′端が存在する。この5′端の位置を塩基配列上に決定することを試みている。また、このleading鎖成分に続いて合成されるlagging鎖成分と考えられるDNA断片もOri付近から合成されており、その3′端がOriの複製方向側の末端付近にあることを示唆する結果も得られている。leading鎖末端に残存している可能性のあるプライマーRNAの検出を試みている。
5.Rep蛋白の複製開始反応における役割の解明のため、この蛋白を完全に精製・純化することを試みている。
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