Bacillus brevisにおけるヒト蛋白質の活性発現と種間障壁の解析

1988 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63560101
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 山形 秀夫 名古屋大学, 農学部, 助教授 (20023468)
• 研究分担者: 鵜高 重三 名古屋大学, 農学部, 教授 (70023463)
• キーワード: バチルス・ブレビス / ヒト蛋白質 / 発現ベクター / 異種蛋白質生産 / ヒト唾液腺αーアミラーゼ / 高分泌変異株 / 種間障壁 / 細胞内プロテアーゼ

研究概要

Bacillus brevisを宿主として、本菌の細胞壁蛋白質遺伝子のプロモーター及びシグナル配列部位を用いた異種遺伝子の発現系においてヒト上皮細胞増殖因子(hEGF)遺伝子は高効率に発現する。この結果、天然のものと同じアミノ酸配列を持つ活性hEGFが分泌され、その培地中の蓄積量は0.2g/lに達した。一方、ヒト唾液腺αーアミラーゼ(hAMY)の遺伝子を用いた同様の実験では、当初hmg/l程度のhAMYしか分泌されなかった。本研究ではhAMY遺伝子の発現に影響を与えている諸要因について解析し、以下の結果を得た。
1.hEGF及びhAMY遺伝子の転写産物を解析し両遺伝子の発現効率の差の原因は主に転写より後の段階にあることを明らかにした。
2.hAMY遺伝子を導入したB__ー.brevis 47を変異誘起処理し、hAMYの高分泌株B__ー.brevis 47Kを分離することに成功した。多コピー数発現ベクターを用いて本変異株にhAMY遺伝子を導入した結果、約30mg/lに達するhAMYの分泌生産が観察された。
3.B__ー.brevisにおいて生産されたhAMYは、SDSポリアグリルアミド電気泳動において天然のものと同一の泳動度を示した。また天然のものとほぼ等しい比活性を持っていた。
4.上記の変異株B__ー.brevis 47KにおいてはhAMY遺伝子のみならず、他の異種遺伝子、例えばClostridium thermasulfurogenesの耐熱性βーアミラーゼ遺伝子の発現効率も約10倍上昇することが見出された。
5.大腸菌においては異種蛋白質を特異的に分解するプロテアーゼLaが存在すること、このプロテアーゼの欠損変異株においては異種蛋白質の生産効率が上昇することが知られている。B__ー.brevisにおいてもこれに類似したプロテアーゼが存在すると推定し、遺伝子の同定、クローン化を行った。現在その塩基配列の解析を行いつつある。

研究成果

• [文献書誌] TSUKAGOSHI,Norihiro: Gene. 65. 285-292 (1988)
• [文献書誌] KITAMOTO,Noriyuki: Journal of Bacteriology.170. 5848-5854 (1988)
• [文献書誌] TAKAO,Makoto: Applied Microbiology and Biotechnology.30. 75-80 (1989)
• [文献書誌] UOZUMI,Nobuyuki: Journal of Bacteriology.171. 375-382 (1989)
• [文献書誌] ADACHI,Takahiro: Journal of Bacteriology.171. (1989)
• [文献書誌] YAMAGATA,Hideo: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.