| 研究課題/領域番号 |
63560102
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
熊谷 英彦 京都大学, 農学部, 助教授 (70027192)
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| 研究分担者 |
矢野 俊博 京都大学, 農学部, 教務職員 (30135553)
山本 憲二 京都大学, 農学部, 助手 (70109049)
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| キーワード | γーグルタミルトランスペプチダーゼ / 大腸菌 / γーグルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子 / 塩基配列 / γーグルタミル化合物 |
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| 研究概要 |
1.大腸菌のγーグルタミルトランスペプチダーゼ、GGT、をコードする遺伝子ggtについて、M13ジデオキシ法により全塩基配列を決定した。そして、GGTの大小各サブユニットN末端アミノ酸配列に相応する塩基配列を検索し、それぞれ相当する部分を見出した。この結果本遺伝子は、シグナルペプチド(25アミノ酸残基)、大サブユニット(365)、小サブユニット(190)をひとつのオープンリーディングフレーム中にコードすることが明らかになった。このような知見は、大腸菌GGTが哺乳動物のそれと同様、一本のポリペプチド鎖として合成された後にプロセッシングを受けることを示唆する。アミノ酸配列の相同性を、ラット腎、ヒト肝GGTについて検索したところ、同一アミノ酸の使用頻度は、30数%であり、それ以外の部分もコンサーバティブな置換であることが観察され、これらGGTが互いによく似た構造をとることが推測された。特に、小サブユニット中の活性中心と思われる部分は、良く保存されていた。プロモーター部位のデータベース検索を試みたが、明確に特定することは出来なかった。
2.ggtの上流にtacプロモーターを導入し、プラスミドpKK223-3へこれをクローニングした。この系の高発現を試みているが、現在のところ目的を達していない。
3.GGTの高生産株SH642から2段階で迅速大量にGGTを精製する方法を種々検討し相当量のGGT精製標品を得た。
4.精製したGGTを使用してS-ベンジルグルタチオンの酵素合成を行い31.2g/Lの収量を得た。
5.さらにチロシン、ヒスチジンなどのホルモン前駆体であるアミノ酸の、γーグルタミル化合物の酵素合成を行い35.7g/Lおよび41.2g/Lの収量を得た。
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