| 研究課題/領域番号 |
63560102
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・発酵学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
熊谷 英彦 京都大学, 農学部, 助教授 (70027192)
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| 研究分担者 |
矢野 俊博 京都大学, 農学部, 教務職員 (30135553)
山本 憲二 京都大学, 農学部, 助手 (70109049)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| キーワード | γ-グルタミルトランスペプチダ-ゼ / γ-グルタミルトランスペプチダ-ゼ遺伝子 / 大腸菌 / γ-グルタミル化合物 / グルタチオン |
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| 研究概要 |
1.大腸菌のγ-グルタミルトランスペプチダ-ゼ(GGT)をコ-ドする遺伝子ggtについて、M13ジデオキシ法により全塩基配列を決定した。この結果、本遺伝子は、シグナルペプチド(25アミノ酸残基)大サブユニット(365)、小サブユニット(190)をひとつのオ-プンリ-ディングフレ-ム中にコ-ドすることが明らかになった。このような知見は、大腸菌GGTが哺乳動物のそれと同様、一本のポリペプチド鎖として合成された後にプロセッシングを受けることを示唆する。アミノ酸配列の相同性を、ラット腎、ヒト肝GGTについて検索したところ、同一アミノ酸の使用頻度は、30数%であり、それ以外の部分もコンサ-バティブな置換であることが観察され、これらGGTが互いによく似た構造をとることが推測された。
2.GGTの高生産株SH642から二段階で迅速大量にGGTを精製する方法を種々検討し相当量のGGT精製標品を得た。
3.精製したGGTを使用してS-ベンジルグルタチオン、またチロシン、ヒスチジンのγ-グルタミル化合物の酸素合成を行い、それぞれ、31.2g/L、35.7g/Lおよび41.2g/Lの収量を得た。
4.ggtの構造遺伝子部分を高発現ベクタ-pKK223-3に組み込むことを二段階のクロ-ニングにより試みた。先ずggtのEcoRV断片(主として大サブユニット部分をコ-ドする)をpKK223-3に組み込む。ついで、この大サブユニット部分が組み込まれたプラスミドに、ggtのHpaI-PstI断片(小サブユニットをコ-ドする)を組み込む。現在第一段階まで成功している。
5.小サブユニット中のセリン75をアラニンまたは、システインと置換する変異をggtに導入した。変異型酵素の基質特異性、熱安定性等について検討中である。
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