| 研究概要 |
Pseudomonas putida F61に見出したホルムアルデヒドジスムターゼは、アルデヒドの不均化、異種アルデヒド間の交叉不均化、およびアルコールとアルデヒドの分子種を交換するアルコール:アルデヒド酸化還元反応を触媒する新しい型の酸化還元酵素である。この酵素の活性中心にはNAD(H)が非共有結合的に強く結合しており、NAD(H)は酵素と結合したままで酸化・還元され、その結果、2種の基質の酸化と還元が同時に起こる。本研究では、この酵素タンパク質とNAD(H)との高い親和性タンパク質化学的に明らかにすることを目的とし、酵素タンパク質のNAD保持の機構と、その一次構造を決定するために必要な酵素遺伝子のクローニングを行った。
1.ホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)のアポ酵素の調製とホロ化.P.putida F61より結晶状に単離したFDMを酸性硫安沈澱法でアポ化する条件を確立した。このアポ酵素は、NAD,NADH,アルチルピリジン-NADによってホロ化し、ホルムアルデヒドの不均化活性を示した。また、一度ホロ化した酵素はアセチルピリジン-NADを除いて、温和な条件では補酵素が遊離しなかった。
2.ホルムアルデヒドジスムターゼ遺伝子のクローニング.P.putidaF61の全ゲノムDNAを対象に、FDM遺伝子のクローニングを行い、組み換え株を得た。ホスト-ベクター系としてP.putida/PKT230を用いた場合には、組み換え株中にFDM活性を見出したが、E.coli/PUC18を用いた時は、SDS-PAG/ウェスタンブロット法でFDMタンパク質の生産は確認できたが、FDM活性を検出することはできなかった。これはNAD(H)が酵素タンパク質中にとり込まれなかったためと考えられ、そのとり込みに特異な機構の存在する可能性があり、極めて興味深い事実である。次年度は当該遺伝子を用いて全塩基配列を決定する。
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