| 研究課題/領域番号 |
63570032
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
河田 光博 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (60112512)
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| 研究分担者 |
上田 秀一 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (60150570)
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| キーワード | in situ ハイブリダイゼーション / 合成オリゴヌクレオチド / オキシトシン / mRNA / エストロゲン / ラット / 室傍核 |
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| 研究概要 |
本年度は、合成オリゴヌクレオチドを用いるin situハイブリダイゼーション法の方法に関するパラメーターの検討を中心に研究を進めたが、ほぼその基礎的検索を終え、オキシトシン遺伝子発現機構の解明に本研究法を応用することができた。オキシトシン前駆体ホルモンをコードするmRNAの全塩基配列から、特異的な部位を選択し、mRNAの5′側と3′側の両者において、これらに相補的な27〜30merのオリゴヌクレオチドを設計した。設計にあたってはとくにバソプレシン前駆体mRNAとのホモロジーを有しないように配慮するとともに、他の生体内物質とも有意なホモロジーを持たないように留意し、GenBankおよびEMBLでのデータベースを利用しその特異性の確認を行った。DNA合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを作成、精製したのち、3′側を^3H・dCTPまたは^<35>S・dATPを用いTdTによる酵素反応によって標識した。さらに標識オリゴヌクレオチドの5′側を^<32>P・dATPを用いT_4kinaseによって標識し、電気泳動法を施行してオリゴヌクレオチドの3′側末端標識数を確認した。標識によってオリゴヌクレオチドの塩基数は増加するが、プローブそのものの特異性に変化はないことがコンピューター解析により明らかとなった。またTdT反応時間を変えることによってオリゴヌクレオチドに付加されるモノヌクレオチド数が調節できるが、約5ー10個の付加が組織切片上で最も良好なシグナルの検出を生じることも判明した。これらのパラメーターの検討ののち、標識オリゴヌクレオチドを用いて、ラットにエストロゲン/プロゲステロン(E_2/P)投与を行い、室傍核におけるオキシトシンmRNA量の変化を各細胞レベルで検索した。すなわち、オートラジオグラフィーで生じた銀粒子数はE_2/P投与によって有意に増加していることが明らかとなった。次年度では、E_2リセプター抗体を用いる免疫組織化学法を併用し、性ホルモンに対するオキシトシン遺伝子発現調節機序を形態学的に追究する。
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