骨格筋横行小管の活動電位と筋小胞体からのCa遊離の関連

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63570062
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 大羽 利治 名古屋市立大学, 医学部, 助教授 (50008330)
• キーワード: シアニン系蛍光色素 / PH160 / 骨格筋膜電位 / 二重マニト-ル間隙法 / 蛍光強度

研究概要

シアニン系蛍光試薬(PH160)は神経細胞に対し低毒性・高感受性をもつ膜電位測定用プロ-ブとして開発された。この色素で筋細胞の膜電位測定が可能か否か検討した。
1.RH160は、5μM濃度で蛍光測定に十分な強度の蛍光(ノイズの約5〜7倍)を発し、励起光照射による退色も少なく、且つ、低毒性であり、この濃度が最適であると判断した。
2.二通りの方法で膜電位を固定し、その時の蛍光強度変化の測定を試みた。初めに外液に濃度変化により電位固定した、2.5〜120mMに種々変化させ、ガラス管微小電極で膜電位を測定した。次に単一筋細胞を5μMのPH160で20分染色、蛍光強度を測定した。その結果、相対蛍光変化量△F/F=8〜10%/100mVと計算された。この値は神経細胞のそれよりやゝ低いものの、筋に応用できるものと判断した。そこで、電位固定している細胞の△F/Fを測定する目的で、2本のガラス微小管電極による膜電位固定を試みた。電極の挿入により筋が傷つき、長時間の電位固定に成功せず、信頼性のある結果が得られなかった。
3.電位固定法をガラス管微小電極法から二重マニト-ル間隙法に変更することとした。この方法は200μm巾のtest compartmentの両側を巾250μmに亘り245mOsm/lマニト-ル液を流し、更にその両側を細胞内環境としたものである。マニト-ル液により電気的に隔絶し、負帰還法でtest compartmontの膜電位を固定し得る。現在、この装置で、Na^+電流の測定が可能となり、I-V Curveを書くことに成功するようになった。筋収縮により、長時間の実験では、徐々にleak電流が増え、隔絶の改良中である。明らかにガラス管微小電極より信頼性が高く、この方法は目的にかなっていると思われる。

研究成果

• [文献書誌] Oba: "Ruthenium red and magnesium ion partially inhibit selver ion-induced release of calcium from sarcoplasmic reticulum of frog skeletal" Jpn.J.Phusiol.39. 241-254 (1989)
• [文献書誌] Koshita: "Caffeine treatment inhibits drug-induced calcium release from sarcoplasmic reticulum and caffeine contracture but not tetanus in frog skeletal nuscle" Can.J.Phusiol.Pharmacol.67. 890-895 (1989)
• [文献書誌] Aoki: "Calcium release from frog sarcoplasmic reticulum by an imidazolyl reagent" Experientia. 45. 978-991 (1989)
• [文献書誌] Liu: "Change in surface chare of sarcoplasmic reticulum membrane may elicit conformational change in sulfhydryl groups of membrane proteins to release calcium" Jpan.J.Physiol.39. 623-627 (1989)
• [文献書誌] Oba: "Chemical modification of sulfhydryl groups inhibits skeletal muscle contraction in frog" Prog.Clin.Biol.Res.327. 765-770 (1990)
• [文献書誌] Liu: "Negative surface charges provoke conformational change of membrane proteins and release of calcium from sarcoplasmic reticulum" Prog.Clin.Biol.Res.327. 779-784 (1990)
• [文献書誌] 大羽利治: "日本臨床:7月号特集「骨格筋疾患」I-5.骨格筋での情報伝達機構" 日本臨床社, (1990)