| 研究概要 |
ピリドキサール酵素は補酵素としてピリドキサール燐酸(PLP)を要求して、アミノ酸を基質としてラセミ化,アミノ基転移、脱炭酸など生体内での重要な反応に広く関与している。これらの酵素群のなかでアスパラギン酸アミノ基転移酵素は活性域の構造と機能について最も良く研究されている。本研究は核磁気共鳴(NMR)法により本酵素の触媒機能の鍵を握る酵素・PLPシッフ塩基及び基質・PLPシッフ塩基の活性域におけるミクロ環境を明らかにすることを目的としている。ブタ心筋より単離した細胞質局在アスパラギン酸アミノ基転移酵素をアポ化し、補酵素の4′位を^<13>Cでエンリッチした〔4′-^<13>C〕PLPにより再構成した。この試料を用いて^<13>CNMR測定実験を行い、〔4′-^<13>C〕に由来するシグナルを163ppm(pH6)に観察し、本研究の推進にNMR法の適用が可能であることを確認し、以下の結果を得た。(1)基質が存在しない状態下でpH滴定実験を行い、pKは6.3と算出され、^1HNMRで得られない情報を得た。(2)本酵素の競争阻害剤であるコハク酸の影響を知るために飽和濃度でのコハク酸の添加実験を行い、pH7.5で補酵素の4′Cはおよそ4ppm低磁場シフトするのを観察した。その滴定曲線はpK7.7を与え、その値は分光学的に得られた結果に近いことを示した。(3)本酵素はシステインスルフィン酸(CS)との反応によってピリドキサール型からピリドキサミン型に変わる。pH5.15でCSを加えると165ppmの4′Cのシグナルは消失しaliphatic領域の40ppmに新しいシグナルを現した。また4′Cの線幅は125±10Hzから75±10Hzに変化し、運動の自由度の増加を示した。これらの結果は第27回NMR討論会(1988、札幌)及び国際ワークショップ(Molecular Approaches to the Elucidation of Biological Function by Stable Isotopes Aided NMR Spectroscopy,1989,大磯)で報告を行った。
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