| 研究概要 |
ピリドキサ-ル酵素は補酵素としてピリドキサ-ル燐酸(PLP)を要求し、アミノ酸を基質としてラセミ化、アミノ基転移、脱炭酸など生体内での重要な反応に広く関与している。これらの酵素群のなかでアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)は活性域の構造と機能について最も良く研究されている。本研究は核磁気共鳴(NMR)法により本酵素の触媒機能の鍵を握る酵素・PLPシッフ塩基及び基質・PLPシッフ塩基の活性域におけるミクロ環境を明らかにすることを目的としている。ブタ心筋より単離した細胞質局在AspATをアポ化し、補酵素の4'位を^<13>Cでエンリッチした[4'-^<13>C]PLPにより再構成し、2-メチルアスパラギン酸(2-MeAsp)との複合体の4'Cの挙動を^<13>CNMRにより観察した。2-MeAspはASpATと安定なexternal aldimineを作るので反応中間体のよいモデルとなる。pH5.6でinternal aldimineの化学シフト値(164.7ppm)を示した4'Cは、50mMの2-MeAsp添加により162.7ppmへと高磁場シフトした。internal aldimine4'Cはイミノ基プロトンの解離状を反映しpHの増加に伴って165.5から160.1ppmまで約5ppmシフトするが、複合体を形成した4'CはpH滴定されなかった。2-MeAsp-AspAT複合体は360及び430nmに吸収帯を有し、それらがexternal aldimineのprotonationの状態を反映していることは分光学的観察の結果から知られている。これらのことから2-MeAsp存在下で観察されたpH不感の化学シフト値162.7ppmはexternal aldimineのprotonated,ketoenamine,deprotonated型混在状態を示していると考えられる。
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