| 研究課題/領域番号 |
63570121
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
指吸 俊次 大分医科大学, 医学部, 助教授 (00019564)
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| 研究分担者 |
調 恒明 大分医科大学, 医学部, 助手 (50179058)
吉田 敏 大分医科大学, 医学部, 助教授 (50158440)
竹下 正純 大分医科大学, 医学部, 教授 (50019551)
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| キーワード | シトクロムb_5還元酵素 / cDNA / 遺伝子構造 / エクソン / cDNA発現 / 部位特異的突然変異 |
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| 研究概要 |
NADH-シトクロムb_5還元酵素のcDNAをヒト肝臓および胎盤ライブラリーからクローニングし、その構造を解析したところ、このcDNAは完全長ではなかった。(1987年)ので、完全長のcDNAを得るべく、3種類のライブラリーをスクリーニングしたが得られなかった。その後、ラット肝臓のcDNAライブラリーを作製し、ヒト肝cDNAをプローブとしてスクリーニングし、完全長のcDNAを得た。その構造解析から、同酵素のN-末端には、メチオニンが1残基ついているだけで、シグナル配列は認められなかった(論文投稿中)。
次に、cDNAをプローブとして、ヒト遺伝子DNAライブラリーから、同酵素の遺伝子をクローニングし、その構造を解析した。同酵素の遺伝子は、完全長30Kbにわたり、9エクソンから成っていることが判明した。また、ラット酵素の遺伝子も同様に9エクソンから成っていることがわかった。この結果、すでに構造解析をした赤血球の可溶性酵素は、N-末端側にある膜結合断片(25アミノ酸残基)を欠いているがその切断部位が遺伝子の第2エクソンのほぼ中央部分に相当していた。このことから、赤血球の可溶性酵素は、スプライシングの違いによってできた異なるmRNAによって規定されたのではなく、タンパク質翻訳後にプロテアーゼ消化により膜結合部分を失ったと考える方が妥当であると示唆された。
現在、同酵素欠損患者の遺伝子構造を解析中である。さらに、cDNAをpUC13ベクターに入れ、大腸菌内で同酵素を発現させる系を確立した。この系を用い、部位特異的にアミノ酸置換をもつ種々の異常酵素を作製し、これらを用いて酵素反応機構の解析を進めている。
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