腎膜輸送・体液調節因子とその異常に関する病態生化学的、分子生物学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63570137
• 研究機関: 国立循環器病センター
• 研究代表者: 三宅 可浩 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 部長 (40028353)
• 研究分担者: 井上 裕康 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (40183743) ; 渡辺 房男 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (40183719) ; 桃井 京子 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 研究員 (90174359) ; 福井 清 国立循環器病センター研究所, 生化学部, 室長 (00175564)
• キーワード: レニン結合蛋白質 / Dーアミノ酸オキシダ-ゼ / 遺伝子構造解析 / 大量発現と精製 / 遺伝子発現機構 / 部位特異的突然変異誘導体

研究概要

ブタ腎cDNAライブラリ-から、レニン結合蛋白質をコ-ドするcDNAクロ-ンを単離し、その塩基配列を決定した。このcDNAは1342塩基からなり、アミノ酸402個からなるレニン結合蛋白質をコ-ドするものであった。また、本蛋白質がシグナルペプチドをもたず、分子内にロイシンジッパ-構造を有することも判明した。さらに、in vitroで発現させたこの蛋白がレニンと高分子型レニンを形成することも判明した。Dーアミノ酸オキシダ-ゼ(DAO)については、ウサギ腎臓についてcDNAのクロ-ニングを行い、DAO活性の検出されないこの組織においてもDAO遺伝子が存在し、コ-ドされているDAO蛋白はブタと同一の347個のアミノ酸からなり、その配列は80%の相同性を有することが判明した。また、ウサギ腎臓には3種のmRNAが存在すること、in vitroでの転写によりDAO RNAは生成するが、翻訳されないことが示され、ウサギ腎臓でのDAO蛋白の発現が翻訳段階で抑制されていることが示唆された。前年度得たDAO cDNAおよびその部位特異的突然変異体を用いて、これらDAOの大量発現系を確立した。すなわち、DAOコ-ド領域を含むcDNA断片をpUC19に挿入し、そのSallーEcoRI断片を平滑断端化してpKKー223ー3発現ベクタ-に挿入、その5'領域を極端に短かくしてからpUC19に再び挿入して大腸菌に移入、DAO蛋白を発現させた。wild、mutant型とも、121の培養液から、抽出、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィ-、高速液体クロマトグラフィ-によるゲルろ過によって精製を行い、約10〜20mgのDAOが得られた。ヒトDAO遺伝子については、前年度、ヒトDNAのEcoRIによるサザンブロットからDAOをコ-ドするDNA断片を得たが、その塩基配列について解析を行い、DAO cDNAの3'側に4個のエクソンと蛋白N末端部分を含む長いエクソン1個の存在が明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Kiyoshi Fukui,Hiroyasu Inoue,Saori Takahashi,and Yoshihiro Miyake: "Biosynthesis of renin binding protein" Biochemical Biophysidcal Research Communications. 164. 265-270 (1989)
• [文献書誌] Hiroyasu Inoue,Kiyoshi Fukui,Saori Takahashi,and Yoshihiro Miyake: "Molecular cloning and sequence analysis of a cDNA encoding a porcine kindney reninーbinding protein" The Journal of Biological Chemistry. 265. (1990)
• [文献書誌] Fusao Watanabe,Kiyoshi Fukui,Kyoko Momoi,and Yoshihiro Miyake: "Siteーspecific mutagenesis of lysineー204,tyrosineー224,tyrosneー228 and histidineー307 of porcine kidney Dーamino acid oxidase and the implications as to its catalytic function" The Journal of Biochemistry. 105. 1024-1029 (1989)
• [文献書誌] Fusao Watanabe,Kiyoshi Fukui, Kyoko Momoi,and Yoshihiro Miyake: "Expression of normal and abnormal porcine kidney Dーamino acid oxidases in Escherichia coli:Purification and characterization of the enzymes" Biochemical Biophysical Research Communications. 165. 1422-1427 (1989)
• [文献書誌] Hiroyasu Inoue,Kiyoshi Fukui,and Yoshihiro Miyake: "Identification and structure of the rat true tissue kallikrein gene expressed in the kidney" The Journal of Biochemistry. 105. 834-840 (1989)