| 研究課題/領域番号 |
63570459
|
|---|
| 研究機関 | 東邦大学 |
|---|
研究代表者 |
嶋武 博之 東邦大学, 医学部, 助教授 (40010110)
|
|---|
| 研究分担者 |
青木 継稔 東邦大学, 医学部, 教授 (50057585)
菊池 孝信 東邦大学, 医学部, 助手 (50177797)
|
|---|
| キーワード | 神経芽腫 / 網膜芽腫 / 小児診断法 / N-myc遺伝子 / 遺伝子工学 / 抗N-myc特異抗体 |
|---|
| 研究概要 |
本研究の目的は神経芽腫、網膜芽腫、Wilms腫瘍などの小児悪性腫瘍におけるN-myc癌遺伝子産物の発現量と癌悪性度との関連を検索し、新しい小児癌診断法を開発することにある。少量の臨床試料からN-myc遺伝子産物を同定・定量するためには、N-myc遺伝子産物に対する免疫特異性の高い抗体が必要である。そこで、本年度は遺伝子工学的手法を用いて抗原タンパクを大腸菌に大量産生させ、抗N-myc特異抗体を作成した。さらに、N-myc遺伝子産物の高感度定量法の開発に着手した。
1.抗体作成用抗原タンパクはC-mycと相同性の少ないN-myc遺伝子第2エクソンのアミノ酸配列161〜245番の領域のDNA断片を当研究室で開発した大腸菌発現ベクターに挿入し、ベクタータンパクとの融合タンパクとして大腸菌に産生させた。その際、タンパクの安定性を増加させ、かつ抗原性を高めるために、N-myc遺伝子断片を3回直列に連結させベクターに挿入したところ、大腸菌の総タンパク当り約5%の融合タンパクを産生させることができた。単一に精製した融合タンパクをウサギに免疫して抗血清を得た。
2.N-myc遺伝子の転写があるヒト神経芽腫培養株IMR-32とTNB-1およびc-myc遺伝子の発現があるヒト前骨髄球腫培養株HL-60を用いて、本抗体の免疫特異性をWestern Blot法により検討した。その結果、本抗体はc-mycと免疫交差せず、N-mycタンパクに特異的であった。
3.本抗体は抗原認識部位がN-myc遺伝子の限られた一部分であるため、サンドイッチ型RIAを開発するには、これとは別の部位を認識する抗体を作成する必要がある。そこで、N-myc第3エクソンのDNA断片を発現ベクターに挿入し、抗原タンパクの大量産生系を確立した。現在、このタンパクの精製を行なっている。来年度はこれらの抗体を用いてN-mycタンパクの高感度定量法を開発し、臨床診断法を確立する。
|
