| 研究課題/領域番号 |
63570479
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| 研究機関 | 慶応義塾大学 |
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研究代表者 |
橋本 隆 慶應義塾大学, 医学部皮膚科, 専任講師 (20129597)
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| 研究分担者 |
木花 光 慶應義大学, 医学部皮膚科, 講師 (90138082)
多島 新吾 慶應義大学, 医学部皮膚科, 専任講師 (60129525)
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| キーワード | デスモゾーム / デスモプラキン / 単クローン抗体 / 遺伝子クローニング / 発現ベクター |
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| 研究概要 |
ウシ鼻表皮より精製したデスモゾームをマウスに免疫し、ハイブリドーマ法により3種の異なった抗デスモゾーム単クローン抗体および高抗体価の抗血清を得た。マウス培養細胞抽出液の免疫ブロット解析によりこれらの抗体は240kDおよび220kDの蛋白を認識したことより、これらの抗体はデスモゾーム構成蛋白の一つであるデスモプラキンに対する抗体であり、また、この細胞は多量のデスモプラキンを産生していることが判明した。このマウス表皮細胞よりLiClを含んだバッファーを用いてtotal RNAを抽出し、oligo(dT)カラムによりpoly(A)^+RNAを精製した。ランダムプライマーを用いて逆転写酵素により1本鎖DNAとし、RNase HとDNA polymerase Iにより2本鎖DNAを合成後、T4DNA polymeraseにより末端を平滑化した。cDNAの内部EcoRI siteをメチル化した後EcoRIリンカーを連結し、発現ベクターλgt11に組みこんだ。in vitro packagingによりパッケージしcDNAライブラリーとした。デスモプラキン蛋白をコードするcDNAをクローニングするために、上記単クローン抗体および抗血清をプローベとしてcDNA発現ライブラリーを免疫スクリーニングした。すなわち、大腸菌Y1090を宿主として組み換えファージをプレート後42℃にて3ー4時間培養し、IPGTをしみこませたニトロセルロース膜をかぶせて37℃にて一晩培養した。大腸菌の産生する融合蛋白が移しとられたニトロセルロース膜を20%ウシ血清でブロック後、上記抗デスモゾーム抗体を1次抗体、アルカリホスファターゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗血清を2次抗体として反応させ発色させた。現在まで2×10^5の組み換えファージを免疫スクリーニングした結果、6コの陽性クローンを得た。現在、ノーザンブロット解析、エピトープ選択法、塩基配列解析等によりこれらのcDNAクローンを解析中である。
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