プリン体生合成速度の律速 酵素遺伝子の導入と発現に関する分子生物学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63570521
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 板倉 光夫 筑波大学, 臨床医学系, 講師 (60134227)
• キーワード: 組換えDNA / プリン代謝 / 分子生物学 / 糖質コルチコイド / プロモ-タ- / 遺伝子治療 / 増殖刺激 / 酵素誘導

研究概要

『序』プリン体のde novo生合成経路に特異的な初段階を触媒する酵素、amidophosphoribosvltransferase(ATase)の遺伝子調節機序を検討した。
『方法』大腸菌由来のATase遺伝子とMMTV(mouse mammary tumor virus)の糖質コルチコイド依存性のプロモ-タ-との組換えDNAを、ATase酵素活性のみを欠損する哺乳動物培養細胞(CHO ade-A)に導入し、酵素蛋白の発現量を人為的に調節し、プリン体のde novo生合成経路に与える影響の分析を試みた、初代培養肝細胞においてインスリン投与がプリン体のde novo生合成経路に与える影響を分析した。ATaseをラット肝臓より精製し、その非変性分子量とサブユニット分子量を決定した。
『結果』組換えプラスミドの導入株において、大腸菌ATase遺伝子は、約3.8kbの単一バンドへ転写され、細胞抽出液中のATase活性は、野生株と比較して、グルココルチコイド非存在下における4.4%から存在下において、18.3%に増加した。Western analysisにより、57kDの蛋白をコ-ドする大腸菌のATase遺伝子に対し、大腸菌の抽出液には57kDと70kDの、導入株においては72kDの蛋白のみが、グルココルチコイド依存性に発現することを認めた。しかし、DNAおよび、プリン体のde novo生合成速度は増加せず、プリン体非依存生育能は獲得されなかった。初代培養肝細胞に対するインスリン投与によりDNA合成亢進に先行して、プリン体のde novo生合成速度が亢進し、ATaseは、他の同化酵素と共に選択的に誘導された。ラット肝の精製ATaseは、非変性分子量が240kDで、そのサブユニット分子量には62kDと57kDの2種類があった。
『結論』大腸菌ATase遺伝子の人工発現は、発現される酵素活性が少なく、ATase蛋白が細胞内で二つの分子量形態で存在する等のため、細胞内機能が発揮されなかったと考えられる。哺乳動物のATaseは、ヘテロテトラマ-として存在し、増殖刺激に対して選択的に誘導される。

研究成果

• [文献書誌] Itakura M.,Yamaoka T.,Yoshikawa H.,Yamashita K.,Sabina R.,Zalkin H.and Holmes E.W.: "Controllable Expression of an E.coli Amidophosphoribosyltransferase(ATase)gene in ATase-deficient Mammalian Fibroblasts-A Basic Model for Gene Therapy." Purine and Purimidine Metabolism in Man VI. Part A. 531-536 (1989)
• [文献書誌] Yamaoka,T.,Kagita,F.,Yoshikawa H.,Itakura M.and Yamashita K.: "Purification of Rat Liver Amidophosphoribosyltransferase." Purine and Pyrimidine Metabolism in Man VI. Part B. 21-28 (1989)
• [文献書誌] Itakura M.,Yamaoka T.,Yoshikawa H.,and Yamashita K.: "Paradoxical Effects of Glucagon on de novo Purine Synthesis in Rat Liver:In vitro Phosphorylation of Amidophosphoribosyltransferase." Purine and Pyrimidine Metabolism in Man VI. Part B. 29-35 (1989)
• [文献書誌] Tsuchiya M.,Yoshikawa H.,Itakura M.,and Yamashita K.: "Increased de novo Purine Synthesis by Insulin through Selective Enzyme Induction in Primary Cultured Rat Hepatocytes." American Journal of Physiology.Cell Physiology.(MS # C235-9,in press). (1990)
• [文献書誌] Yamaoka T.,Mizutani M.,Kawakami Y.,Tomizawa H.,Itakura M.,and Yamashita K.: "Estimation of Number and Molecular Weight of Subunits in an Oligomeric Protein by Two-dimensional Electrophoresis:Application to the Subunit tructure Analysis of Rat Liver Amidophosphoribbosyltransferase." Analytical Biochemistry. (1990)