| 研究課題/領域番号 |
63570870
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
野地 澄晴 岡山大学, 歯学部, 助手 (40156211)
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| 研究分担者 |
谷口 茂彦 岡山大学, 歯学部, 教授 (50034161)
山合 友一朗 岡山大学, 歯学部, 助手 (00158057)
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| キーワード | 上皮成長因子 / マウス顎下腺 / マウス切歯 / in situ hybridization |
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| 研究概要 |
上皮成長因子(EGF)は、in vitroで、上皮細胞増殖促進効果の他に、骨吸収促進効果などを示し、in vivoでは、マウス顎下腺で常時産生され、また、歯の発生分化において重要な役割を担っている。歯の形成においてどのような細胞が、発生のどの時期からEGFを産生しているのか解明されておらず、また、そのEGFがどの細胞を標的とするのか全く知られていない。そこで、本年度は,マウス(またはラット)の顎下腺及び切歯に着目し、合成EGF遺伝子(172bp)を用いて、アイソトープラベルしたanti-sense RNA(リボプローブ)を合成し、組織切片上のEGF-mRNAとhybridizeさせ、オートラジオグラフ法を用いて検出する方法(in situ hybridization(ISH)法)を検討した。ISH法は、(1)組織の固定、(2)パラフィン包埋、(3)切片の作製、(4)前処理、(5)ハイブリダイゼーション、(6)洗浄、(7)オートラジオグラフの各工程に分けることができるが、その内、(1)と(4)はお互いに密接に関係しており特に重要な工程であることが判った。最も単純で良い結果が得られる条件を検討したところ、4%パラフォルムアルデヒド固定の場合は、タンパク分解酵素処理の工程を必要とせず、良い結果が得られた。オスマウス顎下腺を用いてEGFmRNAを検出したところ、顆粒導管の細胞においてのみEGF遺伝子が発現していることが、確認できた。さらに、オスラットの顎下腺において同様な実験を行ったところ、ラットでは、ほとんど発現していないことが判った。そのラットをテストステロンで処理してところやはり顆粒細胞に、EGFmRNAを検出する事ができた。神経成長因子について同様にISHを行ったところ、EGFとほぼ同様な結果が得られた。以上のことから、我々は、ISH法を確立したと考え、歯の形成に伴うEGF遺伝子に関するISHを行っている。顎下腺を用いた実験で、EDTAを用いた脱灰を行っても、RNAが保存されるかどうか検討中である。
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