1988 年度実績報告書

ヒト血清PAF(血小板活性化因子)アセチルハイドロラーゼ欠損の免疫学的研究1

研究課題

研究課題/領域番号	63571052
研究機関	静岡県立大学
研究代表者	三輪匡男静岡県立大学, 薬学部, 講師 (10046287)
キーワード	血小板活性化因子 / PAF / アセチルハイドロラーゼ / 血清PAFアセチルハイドロラーゼ欠損 / 免疫化学的測定法
研究概要	近年炎症のメディエーターとして注目されているPAFの分解酵素であるアセチルハイドロラーゼ(AH)活性を[^3H]ー標識PAFを用い簡便に測定する方法を開発し、血清中の本酵素を欠損すると考えられる喘息児童を、特に重症喘息患児に高頻度で発見し、その家族調査により常染色体性劣性遺伝することを明らかにしている。本研究はこの酵素欠損を蛋白質レべルで検討するために酵素蛋白質に特異的な抗体を作製し、免疫化学的に検出する方法の確立と酵素蛋白質の産生組織の検索を目的とし、ヒト血清リポ蛋白質(LDL)画分からAHを精製した。LDL画分を0.1%Tween20.ブチルハイドロキシトルエンを含む緩衝液で可溶化後、DEAEセルロファイン、Qーセファロース、セルロファインGCー700、FPLC用モノQ、HPLC用ハイドロキシアパタイト(HCA)カラムを用いて精製を進めSDSーPAGE、IEF電気泳動で単一バンドとなる酵素標品を得た。この酵素標品をBALB/Cマウスに免疫し、常法に従い脾臓細胞をP3Uー1ミエローマ細胞と融合させ、前記精製酵素を結合させたマイクロプレートとPOD結合二次抗体を用いた方法と、AH活性阻害の両面から抗体産生細胞のスクリーニングを現在進めている。健康な学童の血清AH活性が一定に保たれていたことから健康時の酵素活性が先天的に規定されていることを明らかにしているが、川崎病、全身性エリテマトーデス患者では病態にともない本酵素活性の変動が認められ炎症組織などからPAF AHが漏出してくる可能性が示唆された。またPAFアンタゴニスト(CV3988、CVー6209、Rー75317、Rー35319、ONOー6240、WEBー2086、FRー900452)の阻害作用の差から血清型と組織型酵素の存在を明らかにした。この結果は先に示した炎症部位から血液中に組織型AHが漏出することを強く支持するもので血清中のAH測定法を臨床面に応用する為に両タイプの酵素蛋白質を測定出来る方法の開発が必要となった。