| 研究課題/領域番号 |
63580153
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
代謝生物化学
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| 研究機関 | 大阪府立大学 (1989)
大阪大学 (1988) |
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研究代表者 |
今井 嘉郎 大阪府立大学, 農学部, 教授 (60029949)
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| 研究分担者 |
IMAI Yoshio University of Osaka Prefecture, College of Agriculture, Professor (60029949)
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| 研究期間 (年度) |
1988 – 1989
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| キーワード | Pー450 / ラウリン酸水酸化酵素 / テストステロン水酸化活性 / キメラ蛋白質 / 人工的点変異 / 基質特異性 / 構造と機能の相関性 / 動物蛋白質の酵母内発現 |
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| 研究概要 |
ウサギ肝臓ミクロソ-ムのラウリン酸ωー1水酸化酵素の機能部位について、DNA操作(キメラの構築・点変異体の作成などによるcDNAの人工的変異およびcDNAの酵母での人工的発現)に酵素蛋白質の精製・性質同定を組み合わせて解析し、基質との相互作用に重要な役割を果たしている領域を以下の通り明らかにした。
1.アミノ酸残基90ー125および210ー252の領域は共同で基質の結合(正しく配置)に働いて居り、両領域が共にラウリン酸ωー1水酸化酵素の配列であることが水酸化活性に必須である。一方の領域のみがこの配列のものは基質結合能が弱く、活性は殆ど示さない。両領域ともこの配列と異なるものは基質の結合も検知できない。
2.210ー252の領域に見られる特徴的な塩基性アミノ酸クラスタ-は脂肪酸の固定には必須ではなかった。
3.C末端28残基をテストステロン16α水酸化酵素の対応部分で置換すると、脂肪酸水酸化の基質特異性は変わらなが活性強度は約2.5倍に増加し、さらに、テストステロン16β水酸化活性が新たに出現する。本酵素がもともと分子内部にステロイドを結合する構造を持つことおよびC末端部分は基質の選択に関っていることが示唆され、本酵素ではこの部分が基質結合部位へのステロイドのアクセスを妨げているものと思われる。
4.第301残基(および第302残基)の性質は脂肪酸の水酸化位置を決める上で重要な意味を持っており、この残基の炭素鎖1個、基質脂肪酸の炭素鎖2個の長短が水酸化の位置と強度に微妙に影響する。また、この残基の疎水性は酸化型のスピン状態に影響を与え、この残基がヘムの遠位に近接した位置にあることを示している。
5.Pー450の基質作用部位はすべてのPー450分子種を通じて一次構造上共通の配置をしていることが推察される。これは未解析の分子種を調べる際にも人工的機能変換を企図する上でも重要な手掛かりを与える。
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