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1.c-myc遺伝子のDNA複製開始部位の証明
我々はc-myc遺伝子の構造遺伝子上流約2000塩基対にc-mycタンパクの結合域が存在することを見い出し、このクローンのpmyc(H-P)が培養細胞中で染色体外で複製することからこの領域には複製開始領域(ori)存在すること、更にこの領域は転写エンハンサーが同居することを昨年度報告した。このoriを更に確認すべく(pmyc(H-P)をマウス受精卵に注射してトランスジェニックマウスを作製した。得られた親(Fo)、これらをかけ合わせでできた計100匹以上の子、孫マウスでは全てpmyc(H-P)が染色体外で安定に複製した存在していた。このことからc-myc上には真のoriが存在することが証明された。
2.c-mycタンパク結合域、oriエンハンサーの必須領域の同定
Raji細胞の相抽出液を使ったノットプリンティング法により(H-P)領域の21塩基対がタンパク複合体によりブロックされた。種々の長さのオリゴヌクレオチドを作製し、c-mycタンパク結合域、ori、エンハンサーの必須領域を検討したところ、結合には上記21塩基中の7塩基、ori、エンハンサーはこの7塩基を含む各々21、10塩基が必要であることが判明した。また、c-mycタンパクは複合体を形成して存在し、一量体の時は結合能が低いことがわかった。
3.c-mycタンパクのレプレッサーとしての機能
上記(H-P)領域と相補性のあるクローンを遺伝子ライブラリーよりクロー化したところ、同じmycファミリーのN-mycが得られた。両者の関係を調べたところ、c-mycタンパクは同一細胞内でC-mycの発現を転写抑制していることがわかった。
このように、c-mycタンパクは複製のインシューター、転写の促進、抑制作用を有するDNA結合タンパクであることが判明した。
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