生体膜に存在するアニオン輸送系の解明-Cl^-輸送ATPaseの分子生物学的研究

1988 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63617506
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 池田 己喜子 岡山大学, 薬学部, 講師 (20112154)
• 研究分担者: 坪井 誠二 岡山大学, 薬学部, 助手 (50172052)
• キーワード: カサノリ / Cl^-輸送ATPase / CF_1-ATPase / similarity / molecular / cloning

研究概要

1)Cl^-輸送ATPase及びCF_1-ATPaseの蛋白質化学的研究:Cl^-輸送ATPaseのa-及びb-subunit並びにCF_1-ATPaseのα-及びβ-subunitをSDS-PAGE→electroelutionによって精製し、CNBr開裂により得られたフラグメントをSDS-PAGEで分離後、glass-blotting→N-末端よりアミノ酸配列決定を行った。その結果、a-及びα-subunitは高等植物CF_1-ATPaseのα-subunitに対し、又、b-及びβ-subunitは高等植物CF_1-ATPaseのB-subunitに対して、同程度に高い相同性(40〜70%)を示す事が明らかとなった。
2)Cl^-輸送ATPaseの分子生物学的研究:λgt10をベクターとしてそのEcoRI siteに組み込まれたカサノリのcDNAライブラリー(約4×10^5個のクローンを含む)よりCl^-輸送ATPaseのb-subunit N-端末付近の部分アミノ酸配列に対するオリゴヌクレオチド(17mer)をプローブとして約8×10^5個のクローンをスクリーニングした。その結果、3つのpositiveなプラークが得られ、これらを第二次・第三次スクリーニングによリ精製し、最終的にpositiveな15個のプラークを得た。Miniprep法でλDNAを調整後EcoRI消化レサザーンハイブリダイゼーションを行った結果、約4〜6Kbのインサートが組み込まれたものであった。これらを常法に従いpUC19にサブクローニングし、コロニーハイブリダイゼーションにより選別、これらよりMiniprep法でプラスミドDNAを調整した。これらをEcoRI消化し、サザーンハイブリダイゼーションを行った結果、最終的に4つのpositiveなサブクローンを得た(pCLB21、22、141、142と命名)。pCLB21は3.5kb、22は3.4kb、141は1.8kb、142は5.4kbのインサートが組み込まれていた。制限酵素地図より、これら4つのサブクローンはそれぞれ独立なものである事がわかった。又、ハイブリダイゼーションの強さは、pCLB21>141>>22〓142であった。今後、pCLB21及び141からDNAのシークェンシングを進めていく。

研究成果

• [文献書誌] Mikiko,Ikeda;Rainer,Schmid;Dieter Oesterhelt: Biochemistry. (1989)
• [文献書誌] Mikiko,Ikeda;Junko,Kurihara;Shinji,Onmori;Dieter,Oesterhelt.: Biochemistry. (1989)
• [文献書誌] Mikiko,Ikeda;Dieter,Oesterhelt.: Biochemistry. (1989)
• [文献書誌] Mikiko,Ikeda;Friedrich,Lottspeich;Chie,Moritani;Shinji,Ohmori;Dieter,Oesterhelt: Biochemistry. (1989)
• [文献書誌] Mikiko,Ikeda;Chie,Moritani;Shinji,Ohmori;Dieter,Oesterhelt: EMBO J.(1989)
• [文献書誌] Mikiko,Ikeda;Toshitaka,Ohhashi;Mitsuo,Tagaya;Toshio,Fukui: J.Biol.Chem.(1989)