血小板膜糖蛋白GPVの分子生物学的蛋白化学的解析

1988 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63637505
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 蔵本 淳 広島大学, 原爆放射能医学研究所, 教授 (50034070)
• 研究分担者: 深沢 親房 農林水産省食品総合研究所, 室長 ; 今村 展隆 広島大学, 原爆放射能医学研究所, 講師 (60110821) ; 前浜 修爾 広島大学, 医学部付属病院, 助手 (30165659) ; 藤村 欣吾 広島大学, 原爆放射能医学研究所, 助教授 (80034114)
• キーワード: 活性化血小板 / 血小板膜糖蛋白GPV / purification / 抗GPV抗体 / ELISA / 血栓症

研究概要

トロンビンによる血小板活性化メカニズムにおいて、血小板膜糖蛋白GPVはGPIbとともに中心的役割を演じている。GPVを介するトランスメンプランコントロール機構解明を目的にGPVを分離、精製し、その物理化学的性状について検討するとともに、抗GPV抗体を作製し、血漿中に含まれるGPV及びそのフラグメントの定量を試みた。
ヒト血小板を成分採血装置により集め、洗浄後、高塩濃度の緩衝液にてGPVを抽出した。硫安沈澱施行例、ファルマシア社FPLCシステムを用い、Superose12カラム、Mono Qカラムにて分離を進めた後、最終的にWGA-SepharoseによるアフィニティークロマトグラフィーによりGPVを精製した。精製GPVはSDS-PAGEにてPAS及びクマシーブルー陽性の単一バンドとして認められ、分子量は85KDと算定された。C_<18> reverse phaseカラムにより精製度を検討したが、単一のpeakを認め、全収量は2×10^<11>個血小板あたり約110μgであった。精製GPVはトロンビンにより水解され、分子量約65KDのフラグメント(GPVfl)と考えられるバンドに移行したが、Endoglycosidase F処理では変化を認めなかった。等電点電気泳動の結果、GPVはpl5.5〜6.5の間に複数のバンドを形成し、heterogenityが認められた。精製GPVを用いて家兎に免疫し、抗GPVポリクロナール抗体を作製した。抗体は一部ヒト免疫グロブリンとの交叉反応が認められたため、これを吸着除去した。精製抗体はGPV及びGPVflとのみ特異的に反応が認められた。抗GPV抗体を用い、EL1SA法にて血漿中のGPV及びGPVflの定量を試みたところ、正常者血漿中にもGPVの存在が確認され、一部の血栓症患者では病態に応じて増減を示し、血栓性疾患の予知、あるいは診断に有用であると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] 前浜修爾,竹本元義,小田健司,藤元哲郎,下村壮司,藤村欣吾,蔵本淳: 血液と脈管. 19. 374-376 (1988)
• [文献書誌] Osamu,Katoh;Akiro,Kimura;Atsushi,Kuramoto: American Journal of Hematology. 27. 276-280 (1988)
• [文献書誌] Akiro,Kimura;Osamu,Katoh;Atsushi,Kuramoto,: British Journal Hematology. 69. 9-12 (1988)
• [文献書誌] Akiro,Kimura;Osamu,Katoh;Atsushi,Kuramoto,: British Journal Hematology. 69. 153-156 (1988)
• [文献書誌] 藤村欣吾、蔵本淳: 医学のあゆみ. 145. 749-750 (1988)
• [文献書誌] Kingo,Fujimura;Tetsuro,Fujimoto;Atsushi,Kuramoto: "Galcium Signal and Cell Response" Japan scientific societies press springer-verlag, (187-192)
• [文献書誌] 藤村欣吾、藤浜修爾、蔵本淳: "Annual Review 血液1988" 中外医学者, 106-112 (1988)