合成プロ-ブによるin situ Hybridization技術の開発

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63870002
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 安田 健次郎 慶応義塾大学, 医学部, 教授 (90050327)
• 研究分担者: 塩沢 昌英 慶応義塾大学, 医学部, 助手 (50170840) ; 平岡 芳樹 慶応義塾大学, 医学部, 助手 (80218768) ; 山下 修二 慶応義塾大学, 医学部, 講師 (90050666)
• キーワード: in situ hybridization / γ-GTP / in vitro transcription

研究概要

1.標識法の選択
in sieu hybridizationを行うためには、プロ-ブの非特異的結合を防ぎ、かつ検出感度の優れた方法を用いなければ、適正な結果を得ることができない。そこでin situ hybridizationを行う上での標識法を確立するため、SP6systemとルチ-ンに行なわれているmultipleDNA Iabeling systemをノザンハイブリダイゼ-ションを用いて比較した。SP6systemではヒトγGTPcDNAの300bpのBamHI-PstI fragmentをPGEMプラスミドにクロ-ニングして、SP6polymeraseを用いて、in vitro transcriptionを行ない、RNAプロ-ブを作成した。50%ホルムアミド、5×SSPE、5×Denhardt、100μg/ml sermon spermDNA、100μg/ml Yeast tRNAの条件下でRNAプロ-ブとヒト胎児肝由来のpolyA^+RNAとのノザンハイブリダイゼ-ションを行ったところ、2μgのpolyA^+RNAに対して、わずか6時間のオ-トラジオグラフィ-で2.7kbのbandを検出することができた。一方、multipleDNAlabeling systemでは、bandは検出できるが、10μgのpolyA^+RNAに対して、2over nightの露光時間が必要とされる。
2.in situ hybridization
ヒト胎児肝を4%パラホルムアルデヒド固定後、OCTcompoundに包埋、凍結後、薄切する。0.2NHCl に5minに浸漬した後、37℃でproteinaseKを15min処理する。上記条件でRNAプロ-ブを用いて、37℃でPrehybridize、次いでHybridizeしたところ、antisense RNAに反応がみられたが、sense RNAにおいては弱いながらも非特異的反応が認められた。反応に用いたのはビオチン化プロ-ブである。
現在、この非特異的反応を抑えるため、hybridizeさせる温度を上昇させると共に、アイソト-プによる標識も検索中である。

研究成果

• [文献書誌] Kenjiro Yasuda,Shuji Yamashita,and Masahide Shiozawa: "An experimental study on the application of microwave fixation to immunohistochemical studies" Acta histochem.cytochem.22. 91-103 (1989)
• [文献書誌] Masahide Shiozawa,Shuji Yamashita,Sadakazu Aiso,and Kenjiro Yasuda: "A monoclonal antibody against human Kidney gamma-glutamyl transpeptidase;preparation,immunochemical and immunohistochemical characterization" J.Histochem.Cytochem.37. 1053-1061 (1989)
• [文献書誌] Kenjiro Yasuda,Sadakazu Aiso,Takashi Nagatani,and Mitsuhiko Yamada: "Direct observation of immunoreactive sites and antibody molecules by ultra high resolution scanning electron microscope" J.Electron Microscopy Technique. 12. 155-159 (1989)
• [文献書誌] Sadakazu Aiso,Kenjiro Yasuda,Masahide Shiozawa,Hisashi Yamamoto and Takashi Sogo: "Preparation of monoclonal antibodies to glutathione S-transferase-π and its application to immunohistochemistry" J.Histochem.Cytochem.37. 1247-1252 (1989)
• [文献書誌] Shuji Yamashita,Sadakazu Aiso Masahide Shiozawa,and Kenjiro Yasuda: "Immunohistochemical study of gamma-glutamyl transpeptidase with monoclonal antibodies.II.An immunoelectron microscopic study in rat kidney" Acta histochem.cytochem. 22. 367-374 (1989)
• [文献書誌] Kenjiro Yasuda,Masahide Shiozawa,Sadakazu Aiso,Shozo Taniguchi and Shuji Yamashita: "Distribution of gamma-glutamyl transpeptidase in human pancreas:Immunohistochemical study with monoclonal antibody" J.Histochem.Cytochem.38. 339-350 (1990)