体液プロテア-ゼの蛍光性ペプチド基質の開発とその実用化

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63870017
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• 研究分担者: 木村 晧俊 (株)ペプチド研究所, 研究部長 (30072771) ; 宮田 敏行 九州大学, 理学部, 助手 (90183970)
• キーワード: 体液プロテア-ゼ / 蛍光性ペプチド基質 / 可視性ペプチド基質 / 血液凝固VII因子 / 顎下腺カリクレイン / VII因子モノクロ-ナル抗体

研究概要

本研究には、未だ合成ペプチド基質の見つかってない血液凝固IX因子とVII因子に対する蛍光性ないし可視性基質を創製するとともに、過去に開発した蛍光性ペプチド基質の鋭敏な感度を生かすため、体液プロテア-ゼを固定化したモノクロ-ナル抗体に結合させ、プロテア-ゼを分別することなしに測定する方法を考案しようとするものである。
本年度は、第1にマウス顎下腺カリクレインに特異的な合成基質のBoc-Met-Ala-Arg-4-メチルクマリン-7-アミドの開発に成功した。この基質はマウス低分子量キニノ-ゲンの構造解析中に考えついたもので、膵カリクレインや血漿カリクレインでは水解されない顎下腺カリクレインに高い特異性を示すものであった。
第2に、凝固VIIa因子の可視性合成ペプチド基質のBoc-Leu-Thr-Arg-P-ニトロベンジルエステルを創製した。従来、VIIa因子に対する特異的合成基質は皆無であったが、この基質の開発により、VIIa因子と組織因子との分子間相互作用の解析が可能となった。
第3に、VII因子のL鎖を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体をマウス腹水から単離し、そのエピト-プ部位を同定した。この抗体の調製によって、血中のVII因子のみを固定化モノクロ-ナル抗体に結合させ、活性化後、上記の合成基質を活用しつつVIIa因子の活性測定ができることが明らかとなった。VII因子特異的モノクロ-ナル抗体は、(1)ウンプロスロンピンのほか、X因子、IX因子、プロテインCなどに全く反応しない。(2)VII因子のH鎖にも全く結合せず、L鎖とCa^2の共存下で反応する。(3)そのエピト-プは、VII因子のL鎖のNH_2末端側Ser-23〜Cys-50の周辺であると推定される。
本研究の成果を契機として、今後、体液プロテア-ゼの活性測定法の実用化を図りたいと考える。

研究成果

• [文献書誌] Nishimura,H.: "Indentification of a Disaccharide(Xyl-Glc)and a Trisaccharide(Xyl_2-Glc)O-Glycosidically Linked to a Serine Residue in the First Epidermal Growth Factor-like Domain of Human Factors VII and IX and Protein Z and Boving Protein Z." J.Biol.Chem.264. 20320-20325 (1989)
• [文献書誌] Miyata,T.: "Fibrinogen Nagoya:a Replacement of Glutamine-329 by Arginine in the γ-Chain That Impairs the Polymerization of Fibrin Monoment" J.Biochem.105. 730-735 (1089)
• [文献書誌] Sakai,T.: "Blood Clotting Factor IX Kashihara:Amino Acid Substitution of Valine^<182> by Phenylalanine." J.Biochem.105. 756-759 (1989)
• [文献書誌] Miyata,T.: "Facter XII Washington D.C.:Inactive Factor XIIa Resulting from Replacement of Cysteine-571 by Serine." Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.86. 8319-8322 (1989)
• [文献書誌] Suehiro,K.: "Blood Clotting Factor IX B_M Nagoya:Substitution of Arginine-180 by Tryptophan and Its activation by Chymotrypsin." J.Biol.Chem.264. 21257-21265 (1989)
• [文献書誌] Sugimoto,M.: "Factor IX Kawachinagano:impaired function of the Gladomain caused by attached proprptide region due to substitution of arginine by glutamine at position" Br.J.Haematol.72. 216-221 (1989)
• [文献書誌] 徳永文稔,岩永貞昭: "抗リポ多糖因子:その構造と生物活性「代謝」26巻No.5" 中山書店(東京), 11 (1989)
• [文献書誌] 宮田敏行,岩永貞昭: "組織因子「BIOmedica」4巻No.12" 水隆館(東京), 6 (1989)