| 研究課題/領域番号 |
63870046
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
岡 芳知 東京大学, 医学部(病), 助手 (70175256)
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| 研究分担者 |
浅野 知一郎 東京大学, 医学部(病), 医員
赤沼 安夫 朝日生命, 糖尿病研究所, 所長
春日 雅人 東京大学, 医学部(病), 講師 (50161047)
柴崎 芳一 東京大学, 医学部(病), 助手 (80196419)
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| キーワード | 糖輸送担体 / ラジオイムノアッセイ / 合成ペプチド |
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| 研究概要 |
抗体とよく反応する標識ペプチドを作製することがRIA系を組み立てる上で極めて重要であったが、これはペプチドのN末端にチロシンを加えたペプチドを新たに合成することで解決できた。標識はクロラミンTを用いて行いSepPakで精製した。糖輸送担体のC末端部分は細胞内部に存在するため可溶化が必要であり、0.5%トライトンにて可溶化し、アフィニティ精製した抗体と0.1%BSAを加えたPBS中にて室温30分孵置した後、プロテインAセルロファインを加えて30分後に抗原抗体複合物を沈降させた。PBSにて沈降物を洗浄した後、^<125>Iを測定した。標準曲線はヨ-ド化したショ-トペプチドに種々の濃度の非標識ショ-トペプチドを加えて同様の操作を行い作製し、試料中の糖輸送担体量をショ-トペプチド量当りに換算した。
ヒト赤血球で測定してみると、HepG2タイプ糖輸送担体が極めて豊富で、赤血球ゴ-スト(ヘモグロビンを除いた赤血球膜)1μg中には約 ×10^<-3>μgショ-トペプチド相当の糖輸送担体が認められた。これは膜重量の約7%に相当し、従来の報告と一致し、我々のショ-トペプチドに対するRIA系が、HepG2タイプ糖輸送担体を正しく定量できることを示している。
我々はラット肝タイプ糖輸送担体に対しても同様の方法でRIA系を確立したが、ラット肝膜分画1μg当たり約10^<-4>μgショ-トペプチド相当の糖輸送担体が認められるのに対し、ヒト赤血球の糖輸送担体は検出感度以下であった。逆にラット肝膜分画をHepG2タイプ糖輸送担体のRIA系で測定しても検出感度以下であり、これらのRIA系の間に交叉は認められず、各々、HepG2タイプ、ラット肝タイプを特異的に検出するRIA系であることが確認された。
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