| 研究課題/領域番号 |
63870105
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| 研究種目 |
試験研究
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
安河内 幸雄 東京医科学歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (60037398)
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| 研究分担者 |
川口 達夫 東京医科学歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (70191997)
北嶋 繁孝 東京医科学歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (30186241)
横田 英介 九州大学, 医学部, 助手 (60167723)
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| キーワード | NanII / BsuEメチレース / 精製 |
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| 研究概要 |
本年度は日本人の染色体地図作製に関する研究の基礎実験を行なった。パルサフォーシステムを2台購入し、種々の大きさのDNA断片について泳動条件の検討を終了した。一方まれな頻度で切断する制限酵素の開発を行なった。それは種々のメチレースとDpn I(NanII)及びBsuEメチレースとNotIを組合わせる2つの方法である。後者についてはNotIは既にヒト・ゲノムに使用可能な市販品があるので、BsuEメチレースの精製を試みた。Bacillus subtilisの可溶成分からDEAEーセファローズ、DEAE-HPLC及びヘパリンーHPLCカラムクロマトグラフィーにより当メチレースを精製した。最終標品はSDS-PAGE後の銀染色法により45Kのバンドがその活性に関連があること、及びその純度は85%以上であることが推定された。次に2ケ所NotI認識ヌクレオチドの5′側にCを持つプラスミドを作製し、この方法がプラスミドのレベルで目的を達成していることを証明した。前者については、市販メチレースのうちTaqIメチレース(NEB)のみヒト・ゲノムに使用しうることが分かった。しかし市販DpnI(ベーリンガー及びNEB)は非特異的な分解によりヒト・ゲノムには使用できないことがパルス・フィールド電気泳動法により分かった。したがって我々はNeisseria animalisからNanIIの精製を試みた。フォスホセルローズ、Sp-TOYO、セファクリルS-200HR、CM-HPLC、及びヘパリンーHPLCカラムクロマトグラフィーによりNanIIを精製した。次に2ケ所Cla I・Cla I siteを持つプラスミドを作製し、この方法がプラスミドのレベルで目的を達成していることを証明した。現在ヒト・ゲノムへの応用の検討を行なっている。少なくとも上記の精製標品は、ヒト・ゲノムを非特異的な分解しないことが確認された。もしヒト・ゲノムに利用することができるならば、遺伝子クローニングすることにより大量に産生させる予定である。
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