糖鎖をエピト-プとして認識する単クロ-ン抗体の開発

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 63880018
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 木幡 陽 東京大学, 医科学研究所, 教授 (30030852)
• 研究分担者: 北島 徹 東和化成工業株式会社, 研究部, 研究員 ; 保田 立二 岡山大学, 医学部, 教授 (30092357) ; 片桐 拓也 東京大学, 医科学研究所, 助手 (70126100)
• キーワード: 単クロ-ン抗体 / 免疫染色 / エピト-プ / Le^a抗原決定基 / CEA / NFAー2 / TypeI糖鎖 / Nー結合糖鎖

研究概要

糖脂質を薄層プレ-ト上で展開し、これに^<125>I標識した単クロ-ン抗体を反応させてラジオオ-トグラムで検出するMagnani法の開発によって、糖脂質と反応する抗体のエピト-プの解明は急速に進展した。しかし糖タンパク質の糖鎖と反応する抗体にはこのような便利な方法が無い為に、そのエピト-プは殆んど不明のままである。我々は本研究の発展にはこの隘路を打開することが必須と判断して研究を進め、以下のような新しい方法を確立した。1)糖タンパク質のNー結合糖鎖をヒドラジン分解で定量的に少糖として遊離する。2)これをアミノ基含有の薄層プレ-ト上にのせ、そのまま又は適当な溶媒で展開後NaBH_3CN溶液(5%)に漬けた後風乾する。3)室温で16時間放置後、これをマウスの単クロ-ン抗体と反応させ、次いで^<125>Iー抗マウスIgG抗体と反応させて少糖を検出する。この方法を用いてLe^a抗原決定基を含む人乳少糖LNFーIIを抗Le^a抗体で検出したところ50pmolの少糖レベルで検出可能であった。次にCEA関連正常抗原NFAー2をヒドラジン分解にかけてえた少糖を同単クロ-ン抗体で調べたところ、1nmolのサンプル量で陽性となった。我々の先の研究によりNFAー2の糖鎖の約20%がLe^a抗原決定基を持っていることが判明しているので、この結果はLe^a抗原決定基を側鎖に持つNー結合糖鎖を200pmolレベルで検出出来ることを示している。次にNFAー2による感作で作られ、NFAー2の糖鎖と反応することは判明しながら、そのエピト-プが不明であったF48ー60という単クロ-ン抗体を上記の新しい手法を使って構造既知の少糖群との反応性を調べたところ、陽性となる少糖は全てGalβ1→3GlcNAcβ1→という2糖残基(TypeI糖鎖)を非還元末端に持つことが明らかになった。このように我々が開発した免疫〓色法は今後広く、糖タンパク質糖鎖とのみ反応する単クロ-ン抗体の研究に応用されよう。

研究成果

• [文献書誌] Ohbayashi,H.,Endo,T.,Yamashita,K.,Kuroki,M.,Matsuoka,Y.,Kobata,A.: "Novel methods to determine the epitopes on the asparagine-linked oligosaccharides of glycoproteins." Anal.Biochem.182. 200-206 (1989)
• [文献書誌] Endo,T.,Groth,D.,Prusiner,S.B.,Kobata,A.: "Diversity of oligosaccharide structures linked to asparagines of the scrapie prion protein." Biochemistry. 28. 8380-8388 (1989)
• [文献書誌] Tomita,T.,Watanabe,M.,Takahashi,T.,Kumai,K.,Todakuma,T.,Yasuda,T.: "Temperature-sensitive release of adriamycin,an amphiphillic anti-tumor agent,from dipalmitoyl-phosphatidyl choline-cholesterol liposomes." Biochim.Biophys.Acta. 978. 185-190 (1989)
• [文献書誌] Hosoda,K.,Yasuda,T.: "Homogeneous immunoassay for alpha-2 plasmin inhibitor and alpha-2PI-plasmin complex.Application of sandwich liposome immune lysis assay technique." J.Immunol.Methods. 121. 121-128 (1989)
• [文献書誌] Katagiri,T.,Ting,J.P.,Dy,R.,Prokop,C.,Cohen,P.,Earp,H.S.: "Tyrosine phosphorylation of a c-Src-like protein is increased in membranes of CD4^-CD8^-T lymphocytes from 1pr/1pr mice." Mol.Cell.Biol.9. 4914-4922 (1989)
• [文献書誌] Katagiri,T.,Urakawa,K.,Yamanashi,Y.,Semba,K.,Takahashi,T.,Kano,K.: "Overexpression of src family gene for tyrosine-kinase p59^<fyn> in CD4^-CD8^-T cells of mice with a lymphoproliferative disorder." Proc.Natl.Acad.Sci.86. 10064-10068 (1989)
• [文献書誌] Kobata,A.,Furukawa,K.: "Handbook on glycoproteins" Marcel Dekker,Inc.New York, (1990)
• [文献書誌] Yasuda,T.,Ishimori,Y.,Umeda,M.: "Liposome Immune Lysis Assay:Non-isotopic Immunoassay" Plenum Press, 389-399 (1988)