| 研究課題/領域番号 |
63880031
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| 研究種目 |
試験研究
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
椙崎 弘幸 京都大学, 化学研究所, 助手 (60135598)
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| 研究分担者 |
青山 卓史 京都大学, 化学研究所, 助手 (80202498)
高浪 満 京都大学, 化学研究所, 教授 (10027013)
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| キーワード | DNAシークエンシング / Taq DNAポリメラーゼ / 制限酵素 / 修飾酵素 / ドメイン構造 |
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| 研究概要 |
本年度は長距離DNAシークエンシング技術の開発および改良に向けて、以下のことを行なった。
1.Taq DNAポリメラーゼを用いたDNAシークエンシング法の改良
DNAシークエンシングの際、DNA合成酵素として大腸菌のKlenow酵素を用いるとバンドに濃淡が生じ、シークエンスを解析する際のエラーの原因となる。この原因としてKlenow酵素の3′→5′エキソヌクレアーゼ活性が考えられる。そこで、3′→5′エキソヌクレアーゼ活性の無いラットDNAポリメラーゼβとTaq DNAポリメラーゼを用い、DNAシークエンシング法の技術改良を試み、Klenow酵素に比べ濃淡の少ないバンドが生ずることが判った。また、Taq DNAポリメラーゼは合成反応を70℃で行なうことができるため、DNAの二次構造に起因する合成反応の停止が起らず、DNAシークエンシングのDNA合成酵素としてKlenow酵素より優れている。
2.8塩基対を認識する制限酵素の検索
染色体DNA等の巨大DNAの構造解析を行なうには8塩基対あるいはそれ以上の塩基配列を認識してDNAを切断する酵素が不可欠であるが、この種の制限酵素は現在のところ二種類しか知られていない。我々は大腸菌の染色体DNAを基質とし、パルスフィールド電気泳動法により化学研究所に保在されている100種の細菌についてこの種の制限酵素を検索した結果、大腸菌の染色体DNAを約30ケ所で切断する酵素を見つけた。現在その酵素の認識配列の解析を行なっている。また、8塩基対以上を認識する制限酵素を蛋白工学的手法により作製するために、FokI制限修飾系遺伝子とクローニングし、構造解を行ない、修飾酵素のアデニンメチラーゼの活性ドメインの構造を明らかにした。現在、制限酵素のエンドヌクレアーゼおよびDNA認識の活性ドメインの構造を解析中である。
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